2017-12-27
1. 研究背景
家(jia)山(shan)(shan)黧豆，作為人類的(de)(de)(de)(de)食物(wu)(wu)及動物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)飼(si)料，最早可追溯(su)到(dao)新(xin)石器(qi)時代。長期(qi)以來，因(yin)其營養豐富，具有(you)(you)耐(nai)旱(han)、耐(nai)澇、耐(nai)寒等(deng)優良生產性(xing)狀(zhuang),廣受(shou)世界各地的(de)(de)(de)(de)青睞。特別是(shi)在(zai)大(da)旱(han)年(nian)份，在(zai)其它(ta)糧(liang)食作物(wu)(wu)絕(jue)收的(de)(de)(de)(de)情(qing)況下，仍有(you)(you)較(jiao)(jiao)好的(de)(de)(de)(de)收成，因(yin)此(ci)，被(bei)視為干(gan)旱(han)及半干(gan)旱(han)地區首選的(de)(de)(de)(de)優良作物(wu)(wu)，但由于其擁有(you)(you)較(jiao)(jiao)大(da)的(de)(de)(de)(de)基因(yin)組（8.2Gb），易發(fa)生外交，并且含有(you)(you)神(shen)(shen)經細胞毒(du)性(xing)物(wu)(wu)質L-β-L-酰二氨基丙酸（ODAP），過量食用會引(yin)起下肢痙攣性(xing)癱瘓等(deng)原因(yin)，使家(jia)山(shan)(shan)黧豆的(de)(de)(de)(de)種(zhong)植受(shou)到(dao)限制(zhi)。目前國內(nei)外對于該種(zhong)作物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)研究(jiu)也較(jiao)(jiao)少。可喜的(de)(de)(de)(de)是(shi)，今(jin)年(nian)（2017年(nian)）10月(yue)在(zai)Frontier in Plant Science（IF = 4.298）這(zhe)一期(qi)刊(kan)上(shang)發(fa)表了一篇關于家(jia)山(shan)(shan)黧豆的(de)(de)(de)(de)文章(zhang)。這(zhe)篇文章(zhang)主要(yao)是(shi)通過Illumina NextSeqTM 500測序平臺從基因(yin)層面來揭開(kai)家(jia)山(shan)(shan)黧豆的(de)(de)(de)(de)神(shen)(shen)秘面紗。
2. 實驗內容
2.1 對非洲和(he)歐洲的家山(shan)黧豆幼(you)苗(miao)期的根，莖和(he)葉(xie)的混合樣進行轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序分(fen)析
表1 trinity軟件對家山黧豆轉錄組數據的de novo組裝
圖1 家山黧豆unigene的Nr, GO, KEGG, eggNOG, Swissport 數據庫的注釋分(fen)布
如表(biao)1所示(shi)，家(jia)山黧豆(dou)測得(de)142053個轉錄本，經過(guo)拼接得(de)到27431個Unigene。這(zhe)27431個Unigene分別(bie)和NR，GO，KEGG，eggNOG以及Swissprot五種蛋白(bai)數據庫(ku)進行(xing)比(bi)對，發現27431個Unigene 100%比(bi)對到NR數據庫(ku)中家(jia)山黧豆(dou)的蛋白(bai)序列(lie)信息，約72.4%比(bi)對到Swissprot數據庫(ku)（圖1）。
圖2 家山黧豆unigene的GO功能注釋分布
圖(tu)3 家山黧豆unigene的eggNOG功能注釋分布
圖4 家(jia)山(shan)黧(li)豆unigene的KEGG功能(neng)注釋分布
通(tong)過對unigene進行功(gong)(gong)(gong)(gong)能注釋(shi)，發現在GO（圖2）中(zhong)大多數(shu)基因主要(yao)功(gong)(gong)(gong)(gong)能為生(sheng)物過程(cheng)(cheng)中(zhong)的(de)代謝過程(cheng)(cheng)，細(xi)胞(bao)成分(fen)中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)和分(fen)子功(gong)(gong)(gong)(gong)能中(zhong)的(de)結合。在eggNOG（圖3）功(gong)(gong)(gong)(gong)能注釋(shi)中(zhong)大多數(shu)基因主要(yao)聚類于的(de)細(xi)胞(bao)功(gong)(gong)(gong)(gong)能未知功(gong)(gong)(gong)(gong)能和通(tong)用功(gong)(gong)(gong)(gong)能預測；在KEGG（圖4）中(zhong)大多數(shu)基因注釋(shi)為糖(tang)代謝，轉(zhuan)錄，信(xin)號轉(zhuan)導，細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)和死亡，內分(fen)泌系統(tong)以及傳染性疾病。
將(jiang)注(zhu)釋(shi)到的(de)家(jia)山黧豆(dou)的(de)c39901_g1_il基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)與近親——豌豆(dou)的(de)SGR基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)進行(xing)比對（圖5），發現(xian)二者具有高度的(de)一致(zhi)性(xing)，并且(qie)功(gong)能類似，所以家(jia)山黧豆(dou)中(zhong)的(de)c39901_g1_il基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)是豌豆(dou)SGR基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)同系物。這些轉錄組(zu)數據(ju)對于家(jia)山黧豆(dou)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)進一步挖(wa)掘和分(fen)子育種有著極大(da)的(de)幫助。
圖5 家(jia)山黧豆(dou)c39901_g1_il基因與豌豆(dou)的(de)SGR基因蛋白序列(lie)比對結果
2.2 對43種家山(shan)黧豆進行SSR和KASP標記物的檢測
SSR是種(zhong)植資源評價和有(you)效繁殖的(de)強有(you)力的(de)標志之一(yi)，國(guo)內(nei)外眾多(duo)(duo)(duo)研究小組(zu)在很多(duo)(duo)(duo)領域中(zhong)使用(yong)這種(zhong)分子工(gong)具，如基(ji)(ji)因多(duo)(duo)(duo)樣性，DNA指(zhi)紋(wen)、遺傳連(lian)鎖(suo)圖(tu)譜(pu)、QTL映射和等(deng)位基(ji)(ji)因等(deng)研究領域。本篇文章作者(zhe)通過使用(yong)微衛星識別工(gong)具對兩種(zhong)家(jia)山黧豆(dou)的(de)轉錄組(zu)測(ce)序結(jie)果進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)(xing)SSR高通量篩選，篩選出含有(you)SSR的(de)序列后(hou)，根據其側翼設計引(yin)物(wu)。對43種(zhong)家(jia)山黧豆(dou)幼苗期的(de)葉子進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)(xing)基(ji)(ji)因組(zu)DNA提取，進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)(xing)PCR，產物(wu)進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)(xing)聚丙烯(xi)酰胺(an)凝膠電泳(yong)后(hou)硝酸(suan)銀染色。最終確定(ding)了87個多(duo)(duo)(duo)態性引(yin)物(wu)和88個單態性引(yin)物(wu)。
對(dui)于SNP的(de)檢測(ce)(ce)，目前存在很多種(zhong)方(fang)法(fa)(fa)，例(li)如等位基(ji)因(yin)特(te)異性PCR，熒光定(ding)量檢測(ce)(ce)，分子信標與基(ji)因(yin)芯片SNP基(ji)因(yin)分型等，但(dan)這(zhe)些方(fang)法(fa)(fa)均價格昂貴，而KASP作(zuo)為(wei)(wei)一種(zhong)新型的(de)強有力的(de)的(de)SNP檢測(ce)(ce)方(fang)法(fa)(fa)，有著其他方(fang)法(fa)(fa)不(bu)可比擬的(de)優(you)勢，結(jie)果精準，效率高(gao)，價格親民，使(shi)得這(zhe)一方(fang)法(fa)(fa)發展迅速。本(ben)篇(pian)文章對(dui)篩(shai)選(xuan)出的(de)146406 個SNP 隨(sui)機挑選(xuan)50個SNP 基(ji)因(yin)座，使(shi)用(yong)KASP技(ji)術進行(xing)驗證，發現其中(zhong)42個SNP基(ji)因(yin)座可作(zuo)為(wei)(wei)KASP標志(zhi)(zhi)物(wu)，其中(zhong)2個是(shi)單(dan)態(tai)性的(de)，40個是(shi)多態(tai)性的(de)。根據這(zhe)一結(jie)果可以發現，較高(gao)比例(li)的(de)SNP可以作(zuo)為(wei)(wei)KASP標志(zhi)(zhi)物(wu)，那么未來(lai)可以將特(te)定(ding)特(te)征的(de)SNP作(zuo)為(wei)(wei)KASP標志(zhi)(zhi)物(wu)確定(ding)的(de)參考目標。
使(shi)用(yong)兩種計算(suan)方法對43個(ge)家(jia)山(shan)(shan)黧豆的(de)(de)87個(ge)SSR和(he)42個(ge)KASP標(biao)志(zhi)物(wu)制作系統樹(shu)狀(zhuang)圖（圖6）。雖(sui)然這兩種計算(suan)方法得到(dao)的(de)(de)系統樹(shu)狀(zhuang)圖存在細小(xiao)差別，但所有組別之間的(de)(de)關系是相似的(de)(de)。SSR和(he)KASP標(biao)志(zhi)物(wu)的(de)(de)結果(guo)對于(yu)評估家(jia)山(shan)(shan)黧豆基(ji)因的(de)(de)遺傳多樣(yang)性有著(zhu)非常重要的(de)(de)作用(yong)，同時也為家(jia)山(shan)(shan)黧豆的(de)(de)基(ji)因改良育種提供理論參考。
圖6 家山黧豆SSR和(he)KASP標志物系統樹狀圖
本研究的測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
參考文獻：
X Hao, T Yang, R Liu, J Hu, Y Yao, & M Burlyaeva, et al. (2017). An rna sequencing transcriptome analysis of grasspea (lathyrus sativus l.) and development of ssr and kasp markers. Frontiers in Plant Science, 8, 1873.
