RNA 甲基化指發生在RNA 分子上不同位置的甲(jia)基(ji)化修(xiu)飾現象(xiang)，常(chang)見(jian)的RNA轉(zhuan)錄(lu)后修(xiu)飾方式有(you)6-甲(jia)基(ji)腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和5-甲(jia)基(ji)胞(bao)嘧啶(C5-methylcytidine，m5C)。

研究發(fa)(fa)現(xian)，m6A修飾在調控基因(yin)表(biao)達、剪接、RNA 編輯、RNA 穩定性、控制mRNA壽命和降解、介導環狀RNA翻譯等方面扮演重要(yao)角色。因(yin)此MeRIP-seq助力解決細(xi)胞分化(hua)、生(sheng)物(wu)發(fa)(fa)育、疾病發(fa)(fa)生(sheng)發(fa)(fa)展、熱休克反應等生(sheng)物(wu)學問題。

利用甲基化(hua)RNA免(mian)疫共沉淀結合(he)高(gao)通量測(ce)序 (Methylated RNA Immunoprecipitation sequening，MeRIP-seq)技術，可以對(dui)RNA轉錄(lu)后甲基化(hua)修飾圖(tu)譜進(jin)行研究(jiu)，是(shi)表觀(guan)轉錄(lu)組學研究(jiu)的(de)關鍵技術。

RNA甲基(ji)化簡介

表觀遺(yi)傳學(xue)，包括組(zu)蛋白共價修(xiu)飾(covalenthistone modification)、DNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)修(xiu)飾(DNAmethylation)、RNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)修(xiu)飾(RNA methylation)、基(ji)(ji)因組(zu)印(yin)記(genomic imprinting)、基(ji)(ji)因沉默(genesilencing)、RNA 編(bian)輯(RNA editing)及非編(bian)碼RNA(noncoding RNA)等(deng)，是(shi)指(zhi)在(zai)核(he)苷酸序列不發(fa)生(sheng)改(gai)變的(de)情況下(xia)，生(sheng)物(wu)表型或(huo)基(ji)(ji)因表達(da)發(fa)生(sheng)了穩(wen)定的(de)可遺(yi)傳變化(hua)(hua)。RNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)作(zuo)為表觀遺(yi)傳學(xue)研究的(de)重要(yao)內容之一，是(shi)指(zhi)發(fa)生(sheng)在(zai)RNA 分子上不同位(wei)置的(de)甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)修(xiu)飾現(xian)象， 6- 甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)腺嘌呤(N6-methyladenosine， m6A)是(shi)真(zhen)核(he)生(sheng)物(wu)中常見的(de)RNA 轉錄后修(xiu)飾。RNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)在(zai)調控基(ji)(ji)因表達(da)、剪接、RNA 編(bian)輯、RNA 穩(wen)定性、控制mRNA壽(shou)命和降(jiang)解等(deng)方面可能扮演(yan)重要(yao)角色。 相對于DNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)，RNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)(ji)化(hua)(hua)更加(jia)復雜、種(zhong)類繁多、普遍存(cun)在(zai)于各(ge)種(zhong)高等(deng)生(sheng)物(wu)中。

m⁶A修飾的機制與功能

m6A 甲(jia)(jia)(jia)基化(hua)修(xiu)飾(shi)是由一(yi)(yi)個(ge)(ge)多蛋(dan)白(bai)(bai)復合(he)物介導(dao)(dao)產生，目前已知這(zhe)個(ge)(ge)復合(he)物的(de)(de)成分包括METTL3，METTL14 和 WTAP；去(qu)甲(jia)(jia)(jia)基化(hua)酶(mei) FTO 和 ALKBH5則負責擦(ca)除甲(jia)(jia)(jia)基化(hua)修(xiu)飾(shi)基團。在(zai)細胞核中的(de)(de) HNRNPC 負責識(shi)(shi)別(bie)m6A修(xiu)飾(shi)基團，并介導(dao)(dao)mRNA前體(ti)的(de)(de)選擇性剪接(jie)。而另(ling)外一(yi)(yi)個(ge)(ge)m6A識(shi)(shi)別(bie)蛋(dan)白(bai)(bai) HNRNPA2B1則促進 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA。在(zai)細胞質(zhi)中，不(bu)同的(de)(de) m6A 位(wei)點(dian)識(shi)(shi)別(bie)蛋(dan)白(bai)(bai)介導(dao)(dao)不(bu)同的(de)(de)功能(neng)。YTHDF1 和YTHDF3識(shi)(shi)別(bie) m6A 修(xiu)飾(shi) mRNA，通過(guo)與起始因子及(ji)核糖(tang)體(ti)相互作用(yong)促進蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)翻譯，eIF3識(shi)(shi)別(bie)蛋(dan)白(bai)(bai)也會直(zhi)接(jie)綁定到 mRNA 5’UTR 端的(de)(de) m6A位(wei)點(dian)參與翻譯起始。而另(ling)外一(yi)(yi)個(ge)(ge)識(shi)(shi)別(bie)蛋(dan)白(bai)(bai) YTHDF2 與 m6A 的(de)(de)結合(he)將導(dao)(dao)致 mRNA 的(de)(de)降解(jie)。

甲基化測序技(ji)術(shu)原理

MeRIP-seq 測序文(wen)(wen)庫(ku)制(zhi)備過(guo)程如下：首(shou)先(xian)從(cong)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)細胞組(zu)織中(zhong)分(fen)離(li)出RNA，考慮到(dao)(dao)總RNA 中(zhong)含(han)有(you)(you)大(da)量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)rRNA 序列，因此需(xu)要(yao)結(jie)合不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法去除(chu)(chu)其中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)rRNA。對(dui)(dui)(dui)(dui)于(yu)真核(he)生物而(er)(er)(er)(er)言(yan)，常采(cai)用(yong)(yong)(yong)Poly(T)寡核(he)苷酸提取出帶(dai)(dai)Poly(A)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA 去除(chu)(chu)rRNA；而(er)(er)(er)(er)對(dui)(dui)(dui)(dui)不(bu)含(han)Poly(A)尾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉錄本(ben)(ben)(ben)序列以及存在(zai)(zai)部分(fen)降解的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)總RNA 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)而(er)(er)(er)(er)言(yan)，需(xu)要(yao)試劑(ji)盒(he)去除(chu)(chu)rRNA，從(cong)而(er)(er)(er)(er)得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)除(chu)(chu)rRNA 外的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)全部RNA，然后將(jiang)提取出的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA 隨機(ji)(ji)打(da)斷(duan)(duan)。MeRIP-seq 技(ji)術對(dui)(dui)(dui)(dui)帶(dai)(dai)有(you)(you)甲(jia)基化(hua)修(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)(pian)段(duan)（IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)）進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)測序時，需(xu)要(yao)平行(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)一(yi)(yi)(yi)(yi)個對(dui)(dui)(dui)(dui)照樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)（Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)）進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)測序， 其IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)和(he)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)(pian)段(duan)選(xuan)擇(ze)方(fang)法主(zhu)要(yao)有(you)(you)以下2 種：a．將(jiang)打(da)斷(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA 片(pian)(pian)(pian)段(duan)分(fen)成兩(liang)份(fen)，一(yi)(yi)(yi)(yi)份(fen)直(zhi)接(jie)用(yong)(yong)(yong)于(yu)制(zhi)備Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cDNA 文(wen)(wen)庫(ku)，另(ling)(ling)一(yi)(yi)(yi)(yi)份(fen)采(cai)用(yong)(yong)(yong)抗(kang)m6A抗(kang)體(ti)與被打(da)斷(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA 進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)孵育，抓取帶(dai)(dai)有(you)(you)m6A 修(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)(pian)段(duan)，用(yong)(yong)(yong)于(yu)制(zhi)備IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cDNA 文(wen)(wen)庫(ku)．由(you)(you)于(yu)測序得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果不(bu)以所(suo)有(you)(you)RNA 片(pian)(pian)(pian)段(duan)為(wei)背景，稱(cheng)這樣(yang)(yang)(yang)得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)和(he)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)是非成對(dui)(dui)(dui)(dui)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（unpair），在(zai)(zai)進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)數據處理(li)(li)時需(xu)先(xian)對(dui)(dui)(dui)(dui)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)處理(li)(li)。b．取兩(liang)份(fen)相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA 進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)打(da)斷(duan)(duan)，其中(zhong)一(yi)(yi)(yi)(yi)份(fen)所(suo)有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA 片(pian)(pian)(pian)段(duan)都進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)測序，作為(wei)Control樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)，另(ling)(ling)一(yi)(yi)(yi)(yi)份(fen)采(cai)用(yong)(yong)(yong)抗(kang)m6A 抗(kang)體(ti)抓取帶(dai)(dai)有(you)(you)m6A 修(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)(pian)段(duan)進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)測序作為(wei)IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)。由(you)(you)于(yu)測序得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)IP樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)背景為(wei)當(dang)前測序得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)，稱(cheng)這樣(yang)(yang)(yang)得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)和(he)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)是成對(dui)(dui)(dui)(dui)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(pair)，可直(zhi)接(jie)用(yong)(yong)(yong)于(yu)數據處理(li)(li)。獲取測序片(pian)(pian)(pian)段(duan)后（包(bao)括(kuo)IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)測序片(pian)(pian)(pian)段(duan)和(he)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)測序片(pian)(pian)(pian)段(duan))，用(yong)(yong)(yong)隨機(ji)(ji)引物和(he)反轉錄酶從(cong)RNA 片(pian)(pian)(pian)段(duan)合成雙鏈cDNA。然后，對(dui)(dui)(dui)(dui)合成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cDNA進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)末端修(xiu)復并在(zai)(zai)3′端加“A”，使(shi)用(yong)(yong)(yong)特定測序接(jie)頭(adapter)連接(jie)cDNA 片(pian)(pian)(pian)段(duan)兩(liang)端，從(cong)而(er)(er)(er)(er)得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)用(yong)(yong)(yong)于(yu)測序的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cDNA。通(tong)常情(qing)況下，為(wei)了得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)更高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)測序效率，一(yi)(yi)(yi)(yi)般(ban)采(cai)用(yong)(yong)(yong)電泳切膠法獲取一(yi)(yi)(yi)(yi)定長(chang)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cDNA，再對(dui)(dui)(dui)(dui)其進(jin)(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)PCR 擴增，得(de)(de)(de)(de)(de)到(dao)(dao)所(suo)需(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cDNA 文(wen)(wen)庫(ku)。

實驗設計

實驗組(zu)VS對照組(zu)，建議(yi)3-5:3-5

組內(nei)對照：IP組VS in put組（input組主(zhu)要用于比較鑒(jian)定IP組的(de)抗體(ti)特異性結合，是常(chang)備的(de)組分(fen)）

測序模式：PE150

數(shu)據量：20M clean reads

項(xiang)目周期：50天