RNA 甲(jia)基(ji)化指發(fa)生在RNA 分子上不同位置的甲(jia)(jia)基化修(xiu)飾(shi)(shi)現象，常見的RNA轉(zhuan)錄后(hou)修(xiu)飾(shi)(shi)方式有6-甲(jia)(jia)基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和5-甲(jia)(jia)基胞(bao)嘧啶(C5-methylcytidine，m5C)。

研究發現，m6A修飾在調控基因(yin)表達、剪(jian)接、RNA 編輯、RNA 穩(wen)定性(xing)、控制mRNA壽命和降解(jie)、介導環狀(zhuang)RNA翻(fan)譯等(deng)方(fang)面扮演(yan)重要角色。因(yin)此MeRIP-seq助力(li)解(jie)決細胞分化、生(sheng)物發育、疾(ji)病發生(sheng)發展、熱休克反應等(deng)生(sheng)物學問(wen)題。

利(li)用甲基化RNA免(mian)疫共(gong)沉淀結(jie)合高通(tong)量(liang)測序 (Methylated RNA Immunoprecipitation sequening，MeRIP-seq)技(ji)術，可以對RNA轉錄后甲基化修飾圖譜進行研究(jiu)，是表觀轉錄組學研究(jiu)的關(guan)鍵技(ji)術。

RNA甲基(ji)化(hua)簡介

表(biao)觀遺(yi)傳(chuan)學，包括組(zu)蛋白共價修飾(covalenthistone modification)、DNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)修飾(DNAmethylation)、RNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)修飾(RNA methylation)、基(ji)因組(zu)印記(genomic imprinting)、基(ji)因沉默(genesilencing)、RNA 編(bian)輯(RNA editing)及(ji)非編(bian)碼RNA(noncoding RNA)等(deng)，是(shi)指在(zai)核苷(gan)酸序列(lie)不發(fa)生(sheng)改變(bian)的(de)情況(kuang)下，生(sheng)物(wu)表(biao)型(xing)或基(ji)因表(biao)達(da)(da)發(fa)生(sheng)了穩(wen)定的(de)可(ke)遺(yi)傳(chuan)變(bian)化(hua)。RNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)作為表(biao)觀遺(yi)傳(chuan)學研究(jiu)的(de)重(zhong)要(yao)內容之(zhi)一，是(shi)指發(fa)生(sheng)在(zai)RNA 分子(zi)上不同位(wei)置的(de)甲(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)修飾現象， 6- 甲(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)腺嘌(piao)呤(N6-methyladenosine， m6A)是(shi)真(zhen)核生(sheng)物(wu)中(zhong)常見的(de)RNA 轉錄后修飾。RNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)在(zai)調控(kong)基(ji)因表(biao)達(da)(da)、剪接、RNA 編(bian)輯、RNA 穩(wen)定性、控(kong)制mRNA壽命和(he)降解(jie)等(deng)方(fang)面可(ke)能扮演(yan)重(zhong)要(yao)角色。 相(xiang)對(dui)于DNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)，RNA 甲(jia)(jia)(jia)(jia)(jia)基(ji)化(hua)更加復雜、種類繁(fan)多(duo)、普遍存在(zai)于各種高(gao)等(deng)生(sheng)物(wu)中(zhong)。

m⁶A修飾的機制與功能

m6A 甲基(ji)化(hua)修(xiu)(xiu)飾(shi)是由一個(ge)(ge)多(duo)蛋(dan)白(bai)復(fu)合物介(jie)導(dao)產(chan)生，目前已(yi)知這個(ge)(ge)復(fu)合物的(de)成分(fen)包(bao)括METTL3，METTL14 和 WTAP；去(qu)甲基(ji)化(hua)酶 FTO 和 ALKBH5則負責擦除甲基(ji)化(hua)修(xiu)(xiu)飾(shi)基(ji)團。在細(xi)胞(bao)核(he)中的(de) HNRNPC 負責識(shi)(shi)別(bie)m6A修(xiu)(xiu)飾(shi)基(ji)團，并介(jie)導(dao)mRNA前體(ti)的(de)選擇性剪接(jie)。而(er)另外(wai)(wai)一個(ge)(ge)m6A識(shi)(shi)別(bie)蛋(dan)白(bai) HNRNPA2B1則促(cu)進(jin) pri-miRNA 加工成 pre-miRNA。在細(xi)胞(bao)質(zhi)中，不同(tong)的(de) m6A 位點識(shi)(shi)別(bie)蛋(dan)白(bai)介(jie)導(dao)不同(tong)的(de)功能。YTHDF1 和YTHDF3識(shi)(shi)別(bie) m6A 修(xiu)(xiu)飾(shi) mRNA，通過與起始因子及核(he)糖體(ti)相(xiang)互作(zuo)用促(cu)進(jin)蛋(dan)白(bai)質(zhi)翻(fan)譯(yi)，eIF3識(shi)(shi)別(bie)蛋(dan)白(bai)也會直接(jie)綁定到(dao) mRNA 5’UTR 端(duan)的(de) m6A位點參(can)與翻(fan)譯(yi)起始。而(er)另外(wai)(wai)一個(ge)(ge)識(shi)(shi)別(bie)蛋(dan)白(bai) YTHDF2 與 m6A 的(de)結合將(jiang)導(dao)致(zhi) mRNA 的(de)降解。

甲基化測序(xu)技術原理

MeRIP-seq 測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)文(wen)庫制備過程如下：首先從樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)細胞組織(zhi)中(zhong)分離出RNA，考慮到(dao)總RNA 中(zhong)含有(you)大(da)量的(de)(de)(de)(de)(de)rRNA 序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)，因此需要結(jie)合不同的(de)(de)(de)(de)(de)方法(fa)去除其中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)rRNA。對(dui)(dui)(dui)于(yu)(yu)真核(he)生物而(er)言，常采(cai)(cai)用(yong)(yong)Poly(T)寡核(he)苷(gan)酸提取(qu)出帶Poly(A)的(de)(de)(de)(de)(de)RNA 去除rRNA；而(er)對(dui)(dui)(dui)不含Poly(A)尾的(de)(de)(de)(de)(de)轉錄本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)以(yi)及存在(zai)部(bu)分降解的(de)(de)(de)(de)(de)總RNA 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)而(er)言，需要試劑盒去除rRNA，從而(er)得(de)(de)到(dao)除rRNA 外的(de)(de)(de)(de)(de)全部(bu)RNA，然后(hou)將提取(qu)出的(de)(de)(de)(de)(de)RNA 隨(sui)機打(da)(da)斷(duan)。MeRIP-seq 技術對(dui)(dui)(dui)帶有(you)甲基化修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)段(duan)（IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)）進(jin)(jin)行(xing)(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)時(shi)，需要平行(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)一(yi)(yi)(yi)個對(dui)(dui)(dui)照樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)（Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)）進(jin)(jin)行(xing)(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)， 其IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)和(he)(he)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)段(duan)選擇方法(fa)主要有(you)以(yi)下2 種(zhong)：a．將打(da)(da)斷(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)RNA 片(pian)(pian)段(duan)分成(cheng)(cheng)兩(liang)(liang)份，一(yi)(yi)(yi)份直接用(yong)(yong)于(yu)(yu)制備Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)cDNA 文(wen)庫，另(ling)一(yi)(yi)(yi)份采(cai)(cai)用(yong)(yong)抗m6A抗體與被打(da)(da)斷(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)RNA 進(jin)(jin)行(xing)(xing)孵育，抓取(qu)帶有(you)m6A 修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)段(duan)，用(yong)(yong)于(yu)(yu)制備IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)cDNA 文(wen)庫．由于(yu)(yu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)得(de)(de)到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果不以(yi)所(suo)有(you)RNA 片(pian)(pian)段(duan)為(wei)背景，稱這(zhe)樣(yang)(yang)(yang)得(de)(de)到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)和(he)(he)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)是非成(cheng)(cheng)對(dui)(dui)(dui)的(de)(de)(de)(de)(de)（unpair），在(zai)進(jin)(jin)行(xing)(xing)數(shu)據處理(li)時(shi)需先對(dui)(dui)(dui)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)進(jin)(jin)行(xing)(xing)處理(li)。b．取(qu)兩(liang)(liang)份相同的(de)(de)(de)(de)(de)RNA 進(jin)(jin)行(xing)(xing)打(da)(da)斷(duan)，其中(zhong)一(yi)(yi)(yi)份所(suo)有(you)的(de)(de)(de)(de)(de)RNA 片(pian)(pian)段(duan)都進(jin)(jin)行(xing)(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)，作為(wei)Control樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)，另(ling)一(yi)(yi)(yi)份采(cai)(cai)用(yong)(yong)抗m6A 抗體抓取(qu)帶有(you)m6A 修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)段(duan)進(jin)(jin)行(xing)(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)作為(wei)IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)。由于(yu)(yu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)得(de)(de)到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)IP樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)背景為(wei)當前測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)得(de)(de)到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)，稱這(zhe)樣(yang)(yang)(yang)得(de)(de)到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)和(he)(he)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)是成(cheng)(cheng)對(dui)(dui)(dui)的(de)(de)(de)(de)(de)(pair)，可直接用(yong)(yong)于(yu)(yu)數(shu)據處理(li)。獲取(qu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)片(pian)(pian)段(duan)后(hou)（包括(kuo)IP 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)片(pian)(pian)段(duan)和(he)(he)Control 樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)(ben)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)片(pian)(pian)段(duan))，用(yong)(yong)隨(sui)機引物和(he)(he)反轉錄酶從RNA 片(pian)(pian)段(duan)合成(cheng)(cheng)雙(shuang)鏈(lian)cDNA。然后(hou)，對(dui)(dui)(dui)合成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)cDNA進(jin)(jin)行(xing)(xing)末端修(xiu)(xiu)復并在(zai)3′端加“A”，使用(yong)(yong)特定(ding)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)接頭(adapter)連接cDNA 片(pian)(pian)段(duan)兩(liang)(liang)端，從而(er)得(de)(de)到(dao)用(yong)(yong)于(yu)(yu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)cDNA。通常情況(kuang)下，為(wei)了(le)得(de)(de)到(dao)更高的(de)(de)(de)(de)(de)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)效率，一(yi)(yi)(yi)般采(cai)(cai)用(yong)(yong)電泳切膠法(fa)獲取(qu)一(yi)(yi)(yi)定(ding)長度的(de)(de)(de)(de)(de)cDNA，再對(dui)(dui)(dui)其進(jin)(jin)行(xing)(xing)PCR 擴增，得(de)(de)到(dao)所(suo)需的(de)(de)(de)(de)(de)cDNA 文(wen)庫。

實驗設(she)計

實驗組VS對(dui)照(zhao)組，建(jian)議(yi)3-5:3-5

組(zu)內(nei)對照：IP組(zu)VS in put組(zu)（input組(zu)主要用于比較(jiao)鑒定IP組(zu)的(de)抗體特異(yi)性結合，是常備的(de)組(zu)分）

測序模式：PE150

數(shu)據(ju)量：20M clean reads

項目周期：50天(tian)