2024-03-14
smRNAPSN-seq是派森諾新推出的一種高通量的微生物單細胞轉錄組分析工具，它不僅可以鑒定新的細胞亞群、分析微生物表型異質性的分子機制、而且可以在單細胞分辨率下應用于微生物演化及微生物與宿主相互作用等領域的研究，其主要實驗流程包括對微生物細胞進行固定透化后進行rRNA的去除，然后制備成合適濃度的單細胞懸液進行10×上機及后續文庫構建和測序。
為了獲得理想(xiang)的測序分析結果，最關鍵的就是制備(bei)高(gao)質量的單(dan)細胞懸液(ye)，而影響單(dan)細胞懸液(ye)主要因素之(zhi)一是樣(yang)(yang)本(ben)的質量。對(dui)(dui)于(yu)特殊處(chu)理樣(yang)(yang)本(ben)，為了鎖定(ding)實驗樣(yang)(yang)本(ben)初始轉錄本(ben)狀態，同時(shi)減少寄送樣(yang)(yang)本(ben)帶來的影響，我們更(geng)建(jian)議老師(shi)在送樣(yang)(yang)時(shi)選擇先對(dui)(dui)樣(yang)(yang)本(ben)進行甲醛固定(ding)后再寄送（詳(xiang)細描述見“”）。但因為不(bu)同地區距離長短導致快遞送(song)達時長不(bu)一，固定后(hou)樣(yang)本長時間(jian)處(chu)于4℃環境下，會(hui)對樣(yang)本本身質量有影(ying)(ying)響(xiang)嗎(ma)？會(hui)影(ying)(ying)響(xiang)后(hou)續透化、去rRNA的效果嗎(ma)？拒絕推測，我們用數據說(shuo)話！
選擇大腸桿菌為實(shi)驗(yan)對象(xiang)，將(jiang)菌液進行(xing)過夜固(gu)(gu)定后(hou)分別(bie)置于4℃保存0~4 d，對獲得的5份(fen)固(gu)(gu)定后(hou)樣(yang)(yang)品進行(xing)RNA提取(qu)，并對其進行(xing)2100質檢（如圖1所示），結果發現5個樣(yang)(yang)本(ben)峰型一(yi)致，未發生降解。后(hou)續將(jiang)所得RNA進行(xing)rRNA去除(chu)、建庫以及上機測(ce)序。
圖1 RNA2100質檢結果
A，0 d；B，1 d；C，2 d；D，3 d；E，4 d；
測(ce)序下機(ji)后對數(shu)據進(jin)行質檢(jian)，如(ru)(ru)表(biao)1所(suo)示，下機(ji)數(shu)據Q30在96%以上(shang)，測(ce)序質量良好(hao)，然后對樣(yang)本中rRNA占比(bi)進(jin)行分析（如(ru)(ru)圖(tu)2），發現0 d時rRNA占比(bi)最低(di)，但第(di)1~3 d時rRNA占比(bi)僅增加0.7%~0.8%。接下來對區域分布進(jin)行統計（如(ru)(ru)圖(tu)3），比(bi)對到(dao)Exon的reads比(bi)例最高(gao)，基因(yin)覆(fu)蓋度(du)好(hao)，最終對5個樣(yang)本進(jin)行相關性(xing)(xing)檢(jian)驗（如(ru)(ru)圖(tu)4），用皮爾(er)遜(xun)相關系數(shu)表(biao)示樣(yang)品間基因(yin)的表(biao)達水平相關性(xing)(xing)，與(yu)其他樣(yang)本比(bi)較，皮爾(er)遜(xun)相關系數(shu)均大(da)于0.98，表(biao)明各樣(yang)本之(zhi)間的正(zheng)相關性(xing)(xing)高(gao)。
表1 下(xia)機數據統計
圖2 固定后大腸(chang)桿菌不同保存時間處理下rRNA占比
圖3 比(bi)對結果統(tong)計（基因區(qu)域）
A，0 d；B，1 d；C，2 d；D，3 d；E，4 d；
圖4 樣品(pin)相(xiang)關性(xing)檢(jian)驗
對微生物細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)進(jin)行固定(ding)(ding)(ding)不(bu)僅(jin)(jin)可(ke)以(yi)鎖(suo)定(ding)(ding)(ding)微生物細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)瞬時狀態(tai)解決原核細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)半衰期短的(de)(de)(de)(de)問題，也可(ke)以(yi)提高轉(zhuan)錄(lu)本(ben)捕(bu)獲效(xiao)率。目(mu)前，在(zai)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)測(ce)(ce)序(xu)中為了固定(ding)(ding)(ding)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)蛋白，常見的(de)(de)(de)(de)方法是通過多聚(ju)甲醛 （PFA） 固定(ding)(ding)(ding)，PFA固定(ding)(ding)(ding)不(bu)僅(jin)(jin)有(you)更強的(de)(de)(de)(de)交(jiao)聯作用而(er)且在(zai)測(ce)(ce)序(xu)中發現(xian)(xian)(xian)PFA 可(ke)以(yi)更好地保持細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)結構的(de)(de)(de)(de)完整(zheng)性(xing)，可(ke)檢(jian)測(ce)(ce)更多數量的(de)(de)(de)(de)基因(yin)和(he)轉(zhuan)錄(lu)本(ben)，同時利用PFA固定(ding)(ding)(ding)進(jin)行的(de)(de)(de)(de)FD-seq與(yu)Drop-seq對比發現(xian)(xian)(xian)，兩者有(you)相似(si)的(de)(de)(de)(de)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)捕(bu)獲效(xiao)率及基因(yin)數[1]。Yunxia Guo [2]等人通過對腦組織進(jin)行單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)測(ce)(ce)序(xu)發現(xian)(xian)(xian)，新鮮PFA固定(ding)(ding)(ding)和(he)凍存樣本(ben)有(you)相似(si)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)組學特(te)征，但(dan)PFA固定(ding)(ding)(ding)超過三天后真實的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)狀態(tai)被破壞(huai)，細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)比例(li)發生變化。因(yin)此，雖(sui)然固定(ding)(ding)(ding)后大腸桿菌樣本(ben)rRNA占比在(zai)1~3 d變化較小(xiao)，但(dan)仍建(jian)議甲醛固定(ding)(ding)(ding)樣本(ben)從樣本(ben)制備到實驗(yan)前應不(bu)超過48h。
[1]Phan, H.V., van Gent, M., Drayman, N. et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun 12, 5636 (2021). //doi.org/10.1038/s41467-021-25871-2. [2]Yunxia Guo a, Junjie Ma b, Zhengyue Li et al. Transcriptomic profiling of nuclei from paraformaldehyde-fixed and formalin-fixed paraffin-embedded brain tissues.Analytica Chimica Acta, 2023, 1281: 341861.
