狼瘡性腎(shen)(shen)炎(yan)(yan)(yan)（lupus nephritis, LN）是系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）最常(chang)見及嚴重(zhong)的(de)(de)并發癥(zheng)之(zhi)一，約(yue)有50-80% SLE患(huan)者具有LN臨(lin)床表現，10-20%患(huan)者發展為終(zhong)末期腎(shen)(shen)臟(zang)病（end stage kidney desease, ESKD），許(xu)多患(huan)者對免(mian)疫治療(liao)和其它治療(liao)方(fang)(fang)式無反(fan)應。盡管目前(qian)已經鑒定了多種臨(lin)床診斷標(biao)志物，如尿蛋白-肌酸酐比值、尿TGF-β等(deng)都(dou)不(bu)能(neng)獨(du)立使用。LN患(huan)者的(de)(de)腎(shen)(shen)臟(zang)通常(chang)具有包括漿細(xi)(xi)胞(bao)、Th1、Th17和殺傷性CD8+T細(xi)(xi)胞(bao)等(deng)多種免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)浸(jin)潤，但目前(qian)參與LN疾病的(de)(de)關鍵免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)還不(bu)清(qing)楚。研(yan)究(jiu)表明，LN腎(shen)(shen)臟(zang)中存在高度復(fu)雜的(de)(de)免(mian)疫微(wei)環(huan)境，腎(shen)(shen)臟(zang)的(de)(de)固(gu)(gu)有細(xi)(xi)胞(bao)與免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)協同參與LN腎(shen)(shen)臟(zang)的(de)(de)炎(yan)(yan)(yan)癥(zheng)反(fan)應，腎(shen)(shen)臟(zang)固(gu)(gu)有細(xi)(xi)胞(bao)不(bu)僅(jin)僅(jin)是LN炎(yan)(yan)(yan)癥(zheng)損傷的(de)(de)靶細(xi)(xi)胞(bao)，還可(ke)通過(guo)分(fen)泌(mi)炎(yan)(yan)(yan)癥(zheng)介質、改變代謝方(fang)(fang)式等(deng)方(fang)(fang)式影(ying)響免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)功能(neng)狀態，促進腎(shen)(shen)臟(zang)炎(yan)(yan)(yan)性微(wei)環(huan)境的(de)(de)形成。故(gu)探究(jiu)LN的(de)(de)腎(shen)(shen)臟(zang)微(wei)環(huan)境中免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)和固(gu)(gu)有細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)組成、分(fen)子特征以及細(xi)(xi)胞(bao)間的(de)(de)相(xiang)互作用對研(yan)究(jiu)LN的(de)(de)發生進展機制具有非常(chang)重(zhong)要的(de)(de)意義(yi)。

為了解析LN腎(shen)(shen)臟微環境并鑒定與LN相(xiang)關的細(xi)胞(bao)(bao)類型，本(ben)研究(jiu)對40例LN患(huan)(huan)(huan)者（包(bao)括(kuo)36例初治患(huan)(huan)(huan)者和(he)4例復發(fa)患(huan)(huan)(huan)者）和(he)6例正常(chang)腎(shen)(shen)活檢(jian)穿(chuan)(chuan)刺(ci)標本(ben)進行單(dan)細(xi)測序(xu)，其(qi)中取(qu)33例LN患(huan)(huan)(huan)者和(he)6例健康對照的腎(shen)(shen)穿(chuan)(chuan)刺(ci)樣本(ben)做(zuo)(zuo)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)轉錄組測序(xu)（scRNA-seq），7例LN患(huan)(huan)(huan)者同時(shi)取(qu)腎(shen)(shen)穿(chuan)(chuan)刺(ci)和(he)外周(zhou)血樣本(ben)做(zuo)(zuo)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)轉錄組測序(xu)（scRNA-seq）聯(lian)合單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)TCR測序(xu)（scTCR-seq），具(ju)體見圖1.1。

圖1.1 單細胞(bao)方案設計總覽

本(ben)研究從46例(li)(li)（LN=40, HC=6）臨(lin)床腎(shen)穿刺樣本(ben)共獲得26,8942個高質(zhi)(zhi)量細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，聚(ju)類后共注釋(shi)為6大類細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，分(fen)別是：B cells、T cells、髓(sui)(sui)系細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（myeloid cells）、 內皮細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（endothelial cells）、上(shang)皮細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（epithelial cells）和間(jian)(jian)充質(zhi)(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（mesenchymal cells）（圖(tu)1.2B）。細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)比(bi)(bi)例(li)(li)分(fen)析(xi)發(fa)現LN組中B細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、髓(sui)(sui)系細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和間(jian)(jian)充質(zhi)(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的比(bi)(bi)例(li)(li)顯(xian)著高于HC組，而(er)上(shang)皮細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的比(bi)(bi)例(li)(li)顯(xian)著低于HC組（圖(tu)1.2C、D）。此外(wai)，發(fa)現T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和髓(sui)(sui)系細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的比(bi)(bi)例(li)(li)與疾病嚴重程度呈正相(xiang)關(guan)（圖(tu)1.2E）。本(ben)研究繼(ji)續做各細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞型與其(qi)臨(lin)床參數之間(jian)(jian)的相(xiang)關(guan)性分(fen)析(xi)，發(fa)CT03_CD4_IL17A、 CM02_CDC2_CD1C和CEpi04_IPTEC_SOX9與24小(xiao)時(shi)尿蛋(dan)白(bai)定量（24h-Upro）呈正相(xiang)關(guan)，與腎(shen)小(xiao)球(qiu)濾過率（eGFR）呈負相(xiang)關(guan)，其(qi)中CDC2s與24h-Upro和eGFR的相(xiang)關(guan)性最強（圖(tu)1.2F）。

圖1.2 LN腎臟單細(xi)胞(bao)圖譜及疾病(bing)相關細(xi)胞(bao)亞群的鑒(jian)定

cDC2s作(zuo)為(wei)前(qian)哨細胞，在(zai)(zai)啟動和(he)維(wei)持適應(ying)(ying)性(xing)免疫(yi)反(fan)應(ying)(ying)中(zhong)(zhong)發揮關鍵(jian)作(zuo)用(yong)。為(wei)了探究(jiu)LN患者腎臟(zang)微環境中(zhong)(zhong)cDC2s的(de)異質(zhi)性(xing)，本(ben)研究(jiu)對其進行亞(ya)(ya)群(qun)細分(fen)，根據經典marker基(ji)因表(biao)達，共注(zhu)釋了四個亞(ya)(ya)群(qun)：C0_DC3、C1_mo-DC、C2_DC2和(he)C3_AS-DC，只有亞(ya)(ya)群(qun)C0_DC3與24h-Upro呈正相(xiang)關，與eGFR呈負相(xiang)關（圖2A-D），提示(shi)DC3s作(zuo)為(wei)cDC2s的(de)組成部分(fen)，可能(neng)在(zai)(zai)LN的(de)發病機制中(zhong)(zhong)起重要作(zuo)用(yong)。流式和(he)免疫(yi)熒光驗證了DC3s存(cun)在(zai)(zai)于(yu)LN患者腎臟(zang)中(zhong)(zhong)，而健康(kang)腎臟(zang)中(zhong)(zhong)幾乎檢(jian)測不(bu)到它(ta)的(de)存(cun)在(zai)(zai)（圖2E、F）。

圖2. LN患者腎臟cDC2s的異質性分析

本(ben)研究對來(lai)(lai)源于腎(shen)(shen)臟(zang)樣本(ben)和(he)(he)血液樣本(ben)的cDC2s細胞進行亞群細分(fen)，共得到6個亞群（圖3A）。基(ji)因集和(he)(he)基(ji)因表達分(fen)析發現(xian)(xian)LN患者(zhe)腎(shen)(shen)臟(zang)DC3s表現(xian)(xian)出促炎和(he)(he)抗原呈遞(di)能(neng)力強的特征（圖3B、C）。轉錄因子(zi)分(fen)析發現(xian)(xian)與(yu)DC成(cheng)熟/激活相關(guan)的轉錄因子(zi)，如STAT4和(he)(he)RELB，只在腎(shen)(shen)臟(zang)DC3s中被特異激活（圖3D）。擬(ni)時軌跡分(fen)析發現(xian)(xian)LN患者(zhe)腎(shen)(shen)臟(zang)DC3s細胞可能(neng)來(lai)(lai)源于外周血或從(cong)腎(shen)(shen)臟(zang)DC分(fen)化而來(lai)(lai)（圖3E-G）。

圖3. LN患者腎臟DC3s表現出(chu)激(ji)活(huo)和促炎表型 

基于腎(shen)臟(zang)DC3s與疾(ji)病(bing)嚴重(zhong)(zhong)程度的(de)(de)臨(lin)床(chuang)相(xiang)關性，LN患(huan)者腎(shen)臟(zang)DC3s浸(jin)潤程度是(shi)否與治(zhi)療(liao)反應相(xiang)關呢？在(zai)(zai)納(na)入研究的(de)(de)40名(ming)(ming)LN患(huan)者中，19名(ming)(ming)完(wan)成了為(wei)(wei)期6個月的(de)(de)免(mian)疫抑(yi)制劑(ji)和(he)糖皮質激素治(zhi)療(liao)的(de)(de)誘導(dao)治(zhi)療(liao)，并在(zai)(zai)治(zhi)療(liao)前對他們的(de)(de)腎(shen)臟(zang)活(huo)檢樣本進行了單細(xi)胞測序。在(zai)(zai)這19名(ming)(ming)患(huan)者中，13名(ming)(ming)患(huan)者獲(huo)得完(wan)全緩解（稱為(wei)(wei)“Responder”），6名(ming)(ming)患(huan)者獲(huo)得不(bu)完(wan)全緩解（稱為(wei)(wei)“Non-responder”），細(xi)胞比例分析(xi)及多(duo)重(zhong)(zhong)免(mian)疫熒光驗證和(he)密度分析(xi)發現，與Responder相(xiang)比，Non-responder腎(shen)臟(zang)DC3s的(de)(de)比例和(he)密度明(ming)顯更高（圖4A-C）。通過單變量(liang)和(he)多(duo)變量(liang)邏輯回(hui)歸分析(xi)，本研究確定(ding)了腎(shen)臟(zang)DC3s是(shi)一(yi)個獨(du)立的(de)(de)預(yu)測因子，能(neng)夠(gou)預(yu)測LN患(huan)者對誘導(dao)治(zhi)療(liao)的(de)(de)反應（圖4D-F）。

圖(tu)4. 腎臟(zang)DC3可作(zuo)為LN患者(zhe)治療反應的潛在生物標(biao)志物

功(gong)能(neng)(neng)富集分析(xi)發(fa)現，與(yu)其他cDC2亞(ya)(ya)群(qun)相(xiang)(xiang)比(bi)，LN患者(zhe)腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)中(zhong)的(de)(de)DC3s細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表現出(chu)更強的(de)(de)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)活(huo)(huo)化功(gong)能(neng)(neng)（圖(tu)5A）, 提示LN患者(zhe)腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)DC3s促(cu)(cu)進局部(bu)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)活(huo)(huo)化。為(wei)探究腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)DC亞(ya)(ya)群(qun)和(he)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)(ya)群(qun)之間的(de)(de)相(xiang)(xiang)互作用，本研(yan)究檢測了其配(pei)體-受體(L-R)對的(de)(de)數量。結果表明，與(yu)其他DC亞(ya)(ya)群(qun)相(xiang)(xiang)比(bi)，腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)DC3s細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)與(yu)CD4+和(he)CD8+T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)相(xiang)(xiang)互作用增(zeng)強（圖(tu)5B）。單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉錄(lu)組聯合TCR分析(xi)得出(chu)在LN患者(zhe)腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)的(de)(de)CD4+和(he)CD8+T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)(ya)群(qun)中(zhong)，Th1（cT02_Th1_IFNG）、GZMK+（cT07_CD8_GZMK）和(he)GZMB+（cT08_CTL_GZMB）細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒性(xing)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)克隆(long)性(xing)增(zeng)殖水(shui)平較(jiao)高(gao)，而(er)在LN患者(zhe)血(xue)液中(zhong)的(de)(de)激(ji)活(huo)(huo)的(de)(de)效應(ying)記憶CD4+T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（稱為(wei)Temra細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，bT04_Temra_CD4)、GZMK+（bT06_CD8_GZMK）和(he)GZMB+細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒性(xing)CD8+T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)表現出(chu)高(gao)水(shui)平的(de)(de)克隆(long)擴增(zeng)（圖(tu)5C、D）。這些觀(guan)察結果提出(chu)了一(yi)種可能(neng)(neng)性(xing)，即CD4+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可能(neng)(neng)在腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)內(nei)被激(ji)活(huo)(huo)，而(er)CD8+ T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在血(xue)液中(zhong)被激(ji)活(huo)(huo)，隨(sui)后浸潤腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)，在LN發(fa)病(bing)過程(cheng)中(zhong)促(cu)(cu)進T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)反應(ying)。綜上(shang)所(suo)述(shu)，腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)DC3s可能(neng)(neng)作為(wei)關鍵(jian)抗原呈遞細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（APC），促(cu)(cu)進腎(shen)(shen)內(nei)Th17和(he)Th1細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)激(ji)活(huo)(huo)和(he)極(ji)化，從而(er)促(cu)(cu)進LN腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)的(de)(de)腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)炎癥反應(ying)（圖(tu)5E-H）。

圖5. LN患者(zhe)腎(shen)臟DC3s促進(jin)腎(shen)內CD4+T細胞活(huo)化

本(ben)研究通過單細胞測(ce)序全面解(jie)析了狼瘡(chuang)性腎炎（LN）患者腎臟微環(huan)境，首次(ci)揭示了腎臟CD163+DC細胞是參與疾病的(de)關鍵(jian)免(mian)疫細胞，可作為LN患者誘(you)導治療(liao)6個月(yue)的(de)療(liao)效(xiao)預測(ce)標(biao)志物，為LN的(de)精準治療(liao)提(ti)供(gong)潛在靶點(dian)和思(si)路。