植物(wu)病害(hai)對(dui)全(quan)(quan)球糧食(shi)安全(quan)(quan)和可持續性(xing)構成嚴重威脅，為(wei)制(zhi)定有效的(de)抗病策略，全(quan)(quan)面(mian)(mian)了解疾病發生(sheng)背(bei)后(hou)的(de)分子機(ji)制(zhi)是十分重要的(de)。截至到目前，植物(wu)不(bu)同組(zu)(zu)織(zhi)、不(bu)同細胞類型(xing)對(dui)于病原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)的(de)反應(ying)仍然不(bu)清楚。宿主不(bu)同細胞類型(xing)對(dui)病原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)產生(sheng)異質(zhi)性(xing)的(de)反應(ying)取決于病原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)的(de)分布(bu)位點和病原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)所處的(de)不(bu)同發育狀態。在真菌(jun)(jun)(jun)造成半活體(ti)(ti)侵(qin)(qin)染(ran)狀態中，植物(wu)組(zu)(zu)織(zhi)表面(mian)(mian)的(de)病原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)發生(sheng)孢(bao)子萌(meng)發，隨后(hou)形(xing)(xing)成附著胞，該結構促進真菌(jun)(jun)(jun)通過角質(zhi)層進入表皮(pi)細胞。一旦病原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)進入到細胞，會形(xing)(xing)成侵(qin)(qin)入性(xing)菌(jun)(jun)(jun)絲，在被(bei)侵(qin)(qin)染(ran)的(de)細胞內部進行活體(ti)(ti)營(ying)養(yang)生(sheng)長。在侵(qin)(qin)染(ran)后(hou)期，病原(yuan)菌(jun)(jun)(jun)從活體(ti)(ti)營(ying)養(yang)轉為(wei)死(si)體(ti)(ti)營(ying)養(yang)，以凋亡組(zu)(zu)織(zhi)為(wei)食(shi)，此(ci)時(shi)，真菌(jun)(jun)(jun)菌(jun)(jun)(jun)絲從起始侵(qin)(qin)染(ran)細胞滲(shen)入到臨近細胞，開始新一輪的(de)生(sheng)長。

為(wei)了(le)抵抗病(bing)原菌(jun)，植(zhi)物(wu)進(jin)化出復雜(za)且強大的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)系統，核心成(cheng)分(fen)(fen)是(shi)負責感(gan)知病(bing)原菌(jun)并激(ji)活免(mian)疫(yi)信號的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)受(shou)(shou)體(ti)。細(xi)胞表面(mian)定(ding)位的(de)(de)(de)(de)類受(shou)(shou)體(ti)蛋白(bai)激(ji)酶（Receptor-like kinases, RLKs）或受(shou)(shou)體(ti)樣蛋白(bai)（receptor-like proteins, RLPs）識(shi)別胞外非自身分(fen)(fen)子(zi)，激(ji)活下(xia)游(you)分(fen)(fen)子(zi)事件(jian)（包括活性氧(yang)的(de)(de)(de)(de)爆(bao)發、鈣離子(zi)內(nei)流、MAPK激(ji)活、轉錄重編程等）。另一類免(mian)疫(yi)受(shou)(shou)體(ti)是(shi)胞內(nei)核苷(gan)酸(suan)結合結構域富亮氨酸(suan)重復序列受(shou)(shou)體(ti)（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat-containing receptors, NLRs），負責感(gan)知細(xi)胞內(nei)效應因(yin)子(zi)（由病(bing)原菌(jun)分(fen)(fen)泌），激(ji)活ETI免(mian)疫(yi)反應（effector-triggered immunity，ETI）。擬(ni)南芥中的(de)(de)(de)(de)NLRs蛋白(bai)根據(ju)N端(duan)結構域不同(tong)分(fen)(fen)為(wei)CC-NLR（coiled-coil-NLR or CNL）、TIR-NLR（Toll/interleukin-1 receptor/resistance protein NLR, TIR-NLR or TNL），RNL（RPW8-like helper NLR, RNL）。截至到(dao)目(mu)前為(wei)止(zhi)，這些受(shou)(shou)體(ti)蛋白(bai)編碼基因(yin)在病(bing)原菌(jun)侵(qin)染過程的(de)(de)(de)(de)不同(tong)細(xi)胞類型(xing)中的(de)(de)(de)(de)表達和(he)功能尚未被(bei)清晰的(de)(de)(de)(de)描述。

1.構建擬南(nan)芥(jie)炭疽病菌侵染期葉片細胞轉錄圖譜

取(qu)生(sheng)(sheng)(sheng)長(chang)15天的擬(ni)南(nan)芥(jie)幼苗，接(jie)種炭(tan)疽(ju)病(bing)(bing)菌孢子，利用活(huo)細(xi)(xi)胞成像監測(ce)病(bing)(bing)原菌侵(qin)染(ran)過程，發現只有(you)很少細(xi)(xi)胞與病(bing)(bing)原菌直接(jie)接(jie)觸（圖(tu)1A），最終選擇接(jie)種24小時和(he)40小時的擬(ni)南(nan)芥(jie)葉(xie)片(pian)組織—分(fen)(fen)別代(dai)表(biao)早期侵(qin)染(ran)和(he)后期侵(qin)染(ran)階段，以未(wei)接(jie)種病(bing)(bing)原菌的擬(ni)南(nan)芥(jie)葉(xie)片(pian)為(wei)對(dui)照(zhao)（圖(tu)1B），酶(mei)解獲得(de)原生(sheng)(sheng)(sheng)質體(ti)，利用10x單細(xi)(xi)胞測(ce)序(xu)平(ping)臺進行單細(xi)(xi)胞轉錄(lu)組測(ce)序(xu)，經(jing)過質量(liang)控(kong)制、批次效應校正，共獲得(de)95,040個(ge)(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)胞，檢測(ce)到23,809個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)，平(ping)均每個(ge)(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)胞檢測(ce)到1583個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)。通過細(xi)(xi)胞聚類(lei)(lei)分(fen)(fen)析產生(sheng)(sheng)(sheng)一個(ge)(ge)(ge)(ge)包(bao)含25個(ge)(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)胞簇(cu)(cu)的葉(xie)片(pian)轉錄(lu)圖(tu)譜，根據每個(ge)(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)胞簇(cu)(cu)特異高(gao)表(biao)達的基(ji)(ji)因(yin)和(he)已經(jing)報道(dao)的細(xi)(xi)胞標(biao)記基(ji)(ji)因(yin)將25個(ge)(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)胞簇(cu)(cu)注釋(shi)為(wei)4個(ge)(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)胞大類(lei)(lei)（葉(xie)肉細(xi)(xi)胞、脈管細(xi)(xi)胞、表(biao)皮(pi)細(xi)(xi)胞、保(bao)衛細(xi)(xi)胞）和(he)2個(ge)(ge)(ge)(ge)未(wei)知細(xi)(xi)胞群（cluster 6和(he)18）（圖(tu)1C）。統計每個(ge)(ge)(ge)(ge)細(xi)(xi)胞類(lei)(lei)群的樣本來源，發現cluster 6, 13, 18, 23, 25主要來源于40-hpi樣本組，而(er)cluster 14, 21, 24主要來自對(dui)照(zhao)組（圖(tu)1D）。

圖1 擬南芥炭疽病(bing)侵(qin)染實驗及葉片細胞圖譜

為了探(tan)究解離原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)制備(bei)(bei)過(guo)程帶來的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)偏差，研究者利用(yong)bulk轉(zhuan)錄(lu)組(zu)測序（對(dui)葉(xie)片組(zu)織直接提取RNA和(he)對(dui)葉(xie)片酶解獲(huo)得的(de)(de)(de)原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)提取RNA）評估(gu)了原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)分離造成的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)改(gai)變(bian)，共獲(huo)得1514個(ge)受原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)制備(bei)(bei)誘導表達的(de)(de)(de)基因，在(zai)每個(ge)cluster中統計表達這(zhe)些基因的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)占(zhan)比，發(fa)現低于5%（圖2A），并(bing)且這(zhe)個(ge)比例在(zai)所有cluster中相對(dui)恒定，表明(ming)原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)制備(bei)(bei)過(guo)程帶來的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)改(gai)變(bian)不會影響細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分群(qun)。進一(yi)步(bu)通過(guo)檢測線粒體(ti)(ti)和(he)葉(xie)綠(lv)體(ti)(ti)基因比例評估(gu)原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)制備(bei)(bei)對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)造成的(de)(de)(de)損傷，結(jie)果顯示，每個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)簇(cu)中只(zhi)有1%的(de)(de)(de)reads來自線粒體(ti)(ti)和(he)葉(xie)綠(lv)體(ti)(ti)基因（圖2B-C）。這(zhe)些結(jie)果表明(ming)，特定的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)特征和(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群(qun)的(de)(de)(de)聚類(lei)主(zhu)要由細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)和(he)對(dui)真菌感染的(de)(de)(de)反應(ying)決定。

圖2 評估原生(sheng)質體制備(bei)過程(cheng)引(yin)入的轉錄變化(hua)

分析每個細胞(bao)類型在(zai)(zai)對照組(zu)和(he)侵染組(zu)的(de)差(cha)異基(ji)(ji)因(yin)（上調表(biao)(biao)達(da)或下調表(biao)(biao)達(da)），將這(zhe)些(xie)基(ji)(ji)因(yin)與bulk轉錄(lu)(lu)組(zu)（對照組(zu) vs 侵染組(zu)）獲(huo)得的(de)差(cha)異基(ji)(ji)因(yin)進(jin)行(xing)比較，發現一些(xie)bulk轉錄(lu)(lu)組(zu)水平沒(mei)有(you)(you)(you)差(cha)異的(de)基(ji)(ji)因(yin)在(zai)(zai)單(dan)細胞(bao)轉錄(lu)(lu)組(zu)有(you)(you)(you)差(cha)異，而在(zai)(zai)單(dan)細胞(bao)轉錄(lu)(lu)組(zu)中沒(mei)有(you)(you)(you)差(cha)異的(de)基(ji)(ji)因(yin)在(zai)(zai)bulk轉錄(lu)(lu)組(zu)中有(you)(you)(you)差(cha)異，表(biao)(biao)明bulk轉錄(lu)(lu)組(zu)和(he)單(dan)細胞(bao)轉錄(lu)(lu)組(zu)對于鑒定差(cha)異基(ji)(ji)因(yin)都是必不可少的(de)手(shou)段。

圖3.不同(tong)轉錄(lu)組技術(shu)獲得的差異基因(yin)比較

擬南芥中有214個編(bian)碼NLRs的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，在本文的(de)單細(xi)胞轉錄組(zu)(zu)中檢測(ce)到了169個，其中71個基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)達(da)(da)(da)(da)量較低（<500 normalized reas counts），會帶來分析上的(de)誤差，這(zhe)些(xie)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)不(bu)納入分析，重點關注余下(xia)的(de)98個基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，分析它們(men)在對照組(zu)(zu)和侵染組(zu)(zu)不(bu)同(tong)細(xi)胞類型的(de)表(biao)達(da)(da)(da)(da)。結果顯示：很多(duo)TNL基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(RPP1,RPP5,SNC1,RPS6)主要表(biao)達(da)(da)(da)(da)在原形(xing)成(cheng)層(ceng)細(xi)胞，并且很多(duo)原形(xing)成(cheng)層(ceng)細(xi)胞表(biao)達(da)(da)(da)(da)的(de)NLRs基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在侵染組(zu)(zu)表(biao)達(da)(da)(da)(da)量升高(gao)(gao)（例(li)(li)如(ru)AT1G72910, AT3G04210, AT5G46450等）。一(yi)些(xie)TNLs基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，例(li)(li)如(ru)RPS1B, CSA1, CHS1，在病原菌(jun)(jun)侵染24小時(shi)的(de)韌皮部伴(ban)胞中高(gao)(gao)表(biao)達(da)(da)(da)(da)，而在侵染40h階段沒有高(gao)(gao)表(biao)達(da)(da)(da)(da)，這(zhe)種被病原菌(jun)(jun)瞬時(shi)誘導表(biao)達(da)(da)(da)(da)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)可能與(yu)病原菌(jun)(jun)抑制宿主免(mian)疫(yi)有關（圖(tu)4A）。

同(tong)(tong)一家族(zu)的(de)(de)RNLs基(ji)因(yin)在(zai)(zai)(zai)(zai)不(bu)同(tong)(tong)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)型中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)有(you)(you)(you)不(bu)同(tong)(tong)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)模(mo)式(shi)：ADR1有(you)(you)(you)3個同(tong)(tong)源(yuan)基(ji)因(yin)—ADR1在(zai)(zai)(zai)(zai)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)形(xing)成(cheng)層(ceng)(ceng)(ceng)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)高表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)，并在(zai)(zai)(zai)(zai)侵(qin)染(ran)40h后(hou)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)升高；ADR1-L1在(zai)(zai)(zai)(zai)維(wei)管束鞘細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)相對高表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)，但在(zai)(zai)(zai)(zai)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)形(xing)成(cheng)層(ceng)(ceng)(ceng)和(he)韌(ren)(ren)(ren)皮(pi)部薄壁(bi)(bi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)受(shou)到(dao)病(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)菌(jun)(jun)誘(you)導表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)；ADR1-L2在(zai)(zai)(zai)(zai)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)形(xing)成(cheng)層(ceng)(ceng)(ceng)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)相對高表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)，在(zai)(zai)(zai)(zai)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)形(xing)成(cheng)層(ceng)(ceng)(ceng)、韌(ren)(ren)(ren)皮(pi)部薄壁(bi)(bi)、韌(ren)(ren)(ren)皮(pi)部伴(ban)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)受(shou)到(dao)病(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)菌(jun)(jun)誘(you)導表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)。NRG1有(you)(you)(you)2個同(tong)(tong)源(yuan)基(ji)因(yin)—NRG1.1表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)在(zai)(zai)(zai)(zai)表(biao)(biao)皮(pi)和(he)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)形(xing)成(cheng)層(ceng)(ceng)(ceng)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，NRG1.2主要表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)在(zai)(zai)(zai)(zai)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)形(xing)成(cheng)層(ceng)(ceng)(ceng)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，但有(you)(you)(you)趣的(de)(de)是，兩個同(tong)(tong)源(yuan)基(ji)因(yin)在(zai)(zai)(zai)(zai)病(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)菌(jun)(jun)侵(qin)染(ran)之(zhi)后(hou)發生相反模(mo)式(shi)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)變化，NRG1.1在(zai)(zai)(zai)(zai)病(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)菌(jun)(jun)侵(qin)染(ran)之(zhi)后(hou)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)下調，而NRG1.2表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)上調，暗示(shi)在(zai)(zai)(zai)(zai)一些細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)型中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，植物(wu)防御(yu)基(ji)因(yin)受(shou)到(dao)病(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)菌(jun)(jun)的(de)(de)抑制(zhi)。與RNLs和(he)TNLs不(bu)同(tong)(tong)，CNLs沒(mei)有(you)(you)(you)呈現出維(wei)管系(xi)統(tong)富集表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)的(de)(de)趨勢。RF9在(zai)(zai)(zai)(zai)保衛細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)高表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)，在(zai)(zai)(zai)(zai)病(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)菌(jun)(jun)侵(qin)染(ran)之(zhi)后(hou)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)升高；SUMM2特異性的(de)(de)在(zai)(zai)(zai)(zai)韌(ren)(ren)(ren)皮(pi)部伴(ban)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)受(shou)到(dao)病(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)菌(jun)(jun)的(de)(de)瞬時誘(you)導表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)（只在(zai)(zai)(zai)(zai)侵(qin)染(ran)24h階段表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)升高）（圖(tu)4A）。除了單(dan)獨察看每個NLRs編碼基(ji)因(yin)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)模(mo)式(shi)，單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可以(yi)分(fen)析同(tong)(tong)一個家族(zu)所有(you)(you)(you)基(ji)因(yin)的(de)(de)整體表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)，發現TNLs編碼基(ji)因(yin)在(zai)(zai)(zai)(zai)四類(lei)(lei)維(wei)管相關的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)型（P, PP, BS, PC）和(he)葉肉(rou)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（M）中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)受(shou)到(dao)病(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)菌(jun)(jun)的(de)(de)誘(you)導表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)，CNLs在(zai)(zai)(zai)(zai)葉肉(rou)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（M）和(he)韌(ren)(ren)(ren)皮(pi)部伴(ban)胞(bao)(bao)(bao)（PC）中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)被(bei)誘(you)導表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)，RNLs在(zai)(zai)(zai)(zai)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)形(xing)成(cheng)層(ceng)(ceng)(ceng)（P）中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)被(bei)誘(you)導表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)(da)（圖(tu)4B）。

由于TNLs蛋(dan)白包含(han)(han)TIR結(jie)構(gou)域(yu)，但TIR結(jie)構(gou)域(yu)也存(cun)(cun)在(zai)于其(qi)它(ta)蛋(dan)白中(zhong)，為了檢測TNLs細(xi)(xi)胞(bao)類(lei)型特異表達(da)的(de)(de)(de)模式是(shi)NLRs特異的(de)(de)(de)，而不(bu)(bu)是(shi)因(yin)為TIR結(jie)構(gou)域(yu)的(de)(de)(de)存(cun)(cun)在(zai)。研究者對(dui)擬南芥中(zhong)所有包含(han)(han)TIR結(jie)構(gou)域(yu)的(de)(de)(de)蛋(dan)白構(gou)建進化(hua)樹，并分(fen)析(xi)它(ta)們(men)在(zai)不(bu)(bu)同(tong)(tong)細(xi)(xi)胞(bao)類(lei)型中(zhong)的(de)(de)(de)表達(da)模式。結(jie)果(guo)顯示，包含(han)(han)TIR結(jie)構(gou)域(yu)的(de)(de)(de)蛋(dan)白在(zai)進化(hua)樹上被(bei)分(fen)為多組(zu)(zu)(zu)，其(qi)中(zhong)一(yi)組(zu)(zu)(zu)主要由TNLs構(gou)成，只有這(zhe)組(zu)(zu)(zu)的(de)(de)(de)基因(yin)呈(cheng)現(xian)出(chu)維管組(zu)(zu)(zu)織富集的(de)(de)(de)表達(da)，很多非(fei)TNLs組(zu)(zu)(zu)蛋(dan)白的(de)(de)(de)編碼基因(yin)在(zai)當前單細(xi)(xi)胞(bao)轉錄組(zu)(zu)(zu)中(zhong)沒有檢測到，表明它(ta)們(men)的(de)(de)(de)表達(da)量較低（圖4C）。這(zhe)些(xie)結(jie)果(guo)表明NLRs具(ju)有細(xi)(xi)胞(bao)類(lei)型特異的(de)(de)(de)表達(da)模式。進一(yi)步分(fen)析(xi)216個類(lei)受(shou)體蛋(dan)白激酶編碼基因(yin)的(de)(de)(de)表達(da)模式，發現(xian)它(ta)們(men)的(de)(de)(de)表達(da)模式與TNLs具(ju)有相關性，表明不(bu)(bu)同(tong)(tong)類(lei)別的(de)(de)(de)免疫(yi)受(shou)體存(cun)(cun)在(zai)協同(tong)(tong)作(zuo)用。

圖4. 植(zhi)物免疫受體基(ji)因表達模式圖

真(zhen)菌(jun)侵(qin)染(ran)(ran)(ran)是(shi)一(yi)個(ge)時(shi)(shi)空動(dong)態(tai)過(guo)程(cheng)，只有(you)一(yi)部分(fen)(fen)(fen)(fen)植物(wu)(wu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)與病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)直接(jie)接(jie)觸。研究者通(tong)過(guo)單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)擬時(shi)(shi)序算法對4大(da)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型（Epidermis, Guard cells, Mesophyll cells, Vasculars）分(fen)(fen)(fen)(fen)別進行軌跡分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)，以捕(bu)獲(huo)在(zai)(zai)(zai)(zai)病(bing)(bing)菌(jun)侵(qin)染(ran)(ran)(ran)過(guo)程(cheng)中基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)動(dong)態(tai)變化：每一(yi)個(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)都(dou)會被賦予一(yi)個(ge)偽時(shi)(shi)間(jian)值表(biao)(biao)(biao)征(zheng)(zheng)它們(men)在(zai)(zai)(zai)(zai)連續(xu)過(guo)程(cheng)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特(te)定狀(zhuang)態(tai)。結果(guo)顯示，被病(bing)(bing)菌(jun)感(gan)染(ran)(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)體(ti)（來自侵(qin)染(ran)(ran)(ran)24-hpi、48-hpi樣(yang)本(ben)）逐漸向偽時(shi)(shi)間(jian)值“1”偏移：24-hpi樣(yang)本(ben)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)位(wei)(wei)于擬時(shi)(shi)軌跡的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)中間(jian)位(wei)(wei)置，48-hpi樣(yang)本(ben)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)位(wei)(wei)于偽時(shi)(shi)間(jian)值“0.5”-“1”之間(jian)（圖5A）。FRK1基(ji)因是(shi)植物(wu)(wu)免(mian)疫響應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)標記基(ji)因，在(zai)(zai)(zai)(zai)粉霉病(bing)(bing)菌(jun)侵(qin)染(ran)(ran)(ran)位(wei)(wei)點被誘導表(biao)(biao)(biao)達(da)。在(zai)(zai)(zai)(zai)本(ben)單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)轉錄組數據集中，FRK1表(biao)(biao)(biao)達(da)隨著偽時(shi)(shi)間(jian)值的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)逐漸升高(gao)（圖5B）。進一(yi)步(bu)通(tong)過(guo)構建(jian)pFRK1::3Venus-NLS擬南(nan)芥轉基(ji)因株系，接(jie)種帶(dai)有(you)綠色熒光(guang)標記的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)炭疽病(bing)(bing)菌(jun)，利用活細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)成像監測FRK1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)變化，發(fa)現黃色熒光(guang)信(xin)號(hao)（表(biao)(biao)(biao)征(zheng)(zheng)FRK1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)）特(te)異出現在(zai)(zai)(zai)(zai)距(ju)離真(zhen)菌(jun)菌(jun)絲較近(jin)(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中，最強(qiang)(qiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)熒光(guang)信(xin)號(hao)出現在(zai)(zai)(zai)(zai)被真(zhen)菌(jun)定殖的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，隨著與菌(jun)絲距(ju)離的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)，熒光(guang)信(xin)號(hao)逐漸降低，表(biao)(biao)(biao)明擬時(shi)(shi)序分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)偽時(shi)(shi)間(jian)值能(neng)夠反映細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)距(ju)離侵(qin)染(ran)(ran)(ran)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)位(wei)(wei)置（圖5C）。在(zai)(zai)(zai)(zai)已報道的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)粉霉病(bing)(bing)菌(jun)侵(qin)染(ran)(ran)(ran)研究中，鑒定到44個(ge)在(zai)(zai)(zai)(zai)侵(qin)染(ran)(ran)(ran)位(wei)(wei)點受(shou)到強(qiang)(qiang)烈(lie)誘導表(biao)(biao)(biao)達(da)（log2IFCI）>20)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因，在(zai)(zai)(zai)(zai)本(ben)擬時(shi)(shi)序分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)中察看這44個(ge)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)，發(fa)現它們(men)在(zai)(zai)(zai)(zai)偽時(shi)(shi)間(jian)值接(jie)近(jin)(jin)“1”的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中高(gao)表(biao)(biao)(biao)達(da)（圖5D）。綜上(shang)，軌跡曲線所(suo)代表(biao)(biao)(biao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)動(dong)態(tai)反應主要反映了真(zhen)菌(jun)病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)在(zai)(zai)(zai)(zai)感(gan)染(ran)(ran)(ran)組織中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不均勻分(fen)(fen)(fen)(fen)布。

通過擬時(shi)(shi)序算法(fa)可以獲得表(biao)達量(liang)具有偽時(shi)(shi)間依(yi)賴(lai)變(bian)化的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)(yin)集(ji)，表(biao)皮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)擬時(shi)(shi)序分析共獲得3個(ge)不同的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)(yin)集(ji)，包含(han)767個(ge)基因(yin)(yin)(yin)(yin)，其(qi)中(zhong)(zhong)296個(ge)基因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)偽時(shi)(shi)間值(zhi)為(wei)(wei)“0”的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)高表(biao)達，這些(xie)基因(yin)(yin)(yin)(yin)沒有報道過與植物(wu)(wu)抗(kang)病相關，因(yin)(yin)(yin)(yin)此，這些(xie)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)可能(neng)距離真菌菌絲(si)較遠，它們的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)組沒有受到病菌侵(qin)染的(de)(de)(de)顯著影響(xiang)。有329個(ge)基因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)偽時(shi)(shi)間值(zhi)為(wei)(wei)“0.5”的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)高表(biao)達，其(qi)中(zhong)(zhong)包含(han)一些(xie)植物(wu)(wu)抗(kang)病的(de)(de)(de)調控因(yin)(yin)(yin)(yin)子，表(biao)明這些(xie)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)免疫(yi)反(fan)(fan)應(ying)被激活。余下142個(ge)基因(yin)(yin)(yin)(yin)特異高表(biao)達在(zai)偽時(shi)(shi)間值(zhi)為(wei)(wei)“1”的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)，包含(han)經典的(de)(de)(de)免疫(yi)響(xiang)應(ying)基因(yin)(yin)(yin)(yin)FRK1和(he)PEP2。這些(xie)結果揭示了距離侵(qin)染點不同位置的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)抗(kang)病反(fan)(fan)應(ying)（圖5E）。

圖5.單細胞擬時序分析(xi)揭(jie)示細胞對真(zhen)菌響應的(de)時空異(yi)質性

保(bao)衛細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)擬時序分析(xi)獲得(de)3個表達(da)量(liang)具有(you)(you)偽(wei)時間(jian)(jian)依賴變化的(de)基(ji)(ji)因(yin)集(ji)，在偽(wei)時間(jian)(jian)值為“1”的(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中高表達(da)的(de)基(ji)(ji)因(yin)富集(ji)到丙酸代(dai)(dai)謝，氮代(dai)(dai)謝和硫代(dai)(dai)謝過(guo)(guo)程，這些過(guo)(guo)程特異(yi)(yi)在侵(qin)染點(dian)的(de)保(bao)衛細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中被(bei)(bei)激(ji)活（圖6A-B）。已有(you)(you)研究報道硫代(dai)(dai)謝參與ABA響應，后(hou)者可以調(diao)控(kong)氣孔關閉。擬南(nan)芥中有(you)(you)106個ABA相關基(ji)(ji)因(yin)，其中51個具有(you)(you)正調(diao)控(kong)作(zuo)用(yong)，55個具有(you)(you)負調(diao)控(kong)作(zuo)用(yong)，在單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)轉錄組保(bao)衛細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中察看這106個基(ji)(ji)因(yin)的(de)表達(da)，并映射回擬時軌跡，發(fa)現正調(diao)控(kong)因(yin)子在保(bao)衛細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中的(de)表達(da)量(liang)隨著偽(wei)時間(jian)(jian)值增(zeng)加逐漸(jian)升高，負調(diao)控(kong)因(yin)子的(de)表達(da)量(liang)隨著偽(wei)時間(jian)(jian)值增(zeng)加逐漸(jian)降(jiang)低，在其它細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類型中則沒有(you)(you)觀察到類似的(de)現象，表明ABA信(xin)號特異(yi)(yi)的(de)在保(bao)衛細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中被(bei)(bei)激(ji)活以應對(dui)病原菌的(de)侵(qin)染（圖6C）。

ABA調控氣(qi)(qi)(qi)孔關閉，在(zai)阻止病原(yuan)菌(jun)進(jin)入葉片質外體(ti)中發揮關鍵(jian)的(de)作用。為了(le)確定炭疽病菌(jun)感染(ran)(ran)(ran)葉片過(guo)程中氣(qi)(qi)(qi)孔開度(du)是否發生變(bian)化，研究者利用野生型擬(ni)南芥葉片，實施炭疽病侵(qin)(qin)染(ran)(ran)(ran)實驗，在(zai)侵(qin)(qin)染(ran)(ran)(ran)40h階段分別觀(guan)察(cha)對照(zhao)組(zu)葉片和侵(qin)(qin)染(ran)(ran)(ran)組(zu)（區(qu)分距離病菌(jun)入侵(qin)(qin)點較遠和較近(jin)的(de)區(qu)域）葉片氣(qi)(qi)(qi)孔開度(du)，發現氣(qi)(qi)(qi)孔入侵(qin)(qin)點遠端的(de)開度(du)大于入侵(qin)(qin)點附近(jin)，但都小于對照(zhao)組(zu)，這些結果表明，面對病原(yuan)菌(jun)的(de)入侵(qin)(qin)，ABA信號在(zai)保衛(wei)細胞中特異性(xing)的(de)被激(ji)活以關閉氣(qi)(qi)(qi)孔，抑制(zhi)病原(yuan)菌(jun)的(de)的(de)進(jin)一步入侵(qin)(qin)。（圖(tu)6D）。

圖6.單細(xi)胞擬時序分析揭示(shi)病(bing)菌(jun)侵染過程中保衛細(xi)胞ABA信號的激活(huo)

分(fen)析每個細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)中(zhong)受到病(bing)菌(jun)侵(qin)染誘導表達的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，表皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、保衛細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、葉肉(rou)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、維管(guan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)分(fen)別(bie)檢測(ce)到541，351，2，20個基(ji)(ji)因(yin)(yin)（圖7A），表明(ming)表皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)和保衛細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)受到病(bing)菌(jun)侵(qin)染的(de)(de)影響最劇烈，對(dui)這4組(zu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)分(fen)別(bie)進行GO富集分(fen)析發現吲哚(duo)相關(guan)的(de)(de)生(sheng)物(wu)過程(cheng)(cheng)被誘導。芥子甙(dai)（Glucosinolate，GSL)）相關(guan)的(de)(de)代謝(xie)(xie)在抗(kang)(kang)病(bing)中(zhong)發揮(hui)重要功能，在單細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)數據集中(zhong)察看(kan)該代謝(xie)(xie)過程(cheng)(cheng)相關(guan)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)表達模(mo)式(shi)，發現很(hen)多(duo)GSL相關(guan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)具有細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)特(te)異的(de)(de)表達模(mo)式(shi)，例如ASA1和TSB1在表皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、保衛細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、維管(guan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)被誘導表達，而(er)(er)在葉肉(rou)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)則沒(mei)有；SUR1和 SOT16在保衛細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)和維管(guan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)誘導表達，而(er)(er)在表皮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)和葉肉(rou)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)則沒(mei)有。這些結果表明(ming)不(bu)同(tong)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)中(zhong)激活不(bu)同(tong)的(de)(de)GSL代謝(xie)(xie)過程(cheng)(cheng)，產生(sheng)不(bu)同(tong)的(de)(de)抗(kang)(kang)病(bing)化合物(wu)以應(ying)對(dui)病(bing)菌(jun)侵(qin)染（圖7B-C）。

在(zai)調(diao)(diao)控(kong)GSL合成(cheng)的(de)(de)轉錄因子(zi)中(zhong)(zhong)，MYB51和MYB122被檢(jian)測(ce)(ce)到分別特異性(xing)的(de)(de)在(zai)維管細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)、表皮(pi)(pi)細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)受到病菌(jun)侵染的(de)(de)誘導表達，其中(zhong)(zhong)MYB122沒有(you)被報道過與抗(kang)病過程相(xiang)關。研究者獲得了(le)MYB122的(de)(de)T-DNA插(cha)入突變體，接種炭疽(ju)(ju)病菌(jun)，與對照組相(xiang)比，突變體葉片產生了(le)增大的(de)(de)病斑（圖7D）。活(huo)細(xi)(xi)胞(bao)成(cheng)像(xiang)觀測(ce)(ce)到突變體中(zhong)(zhong)加(jia)速(su)的(de)(de)真菌(jun)侵染，并(bing)且突變體中(zhong)(zhong)菌(jun)絲形成(cheng)更多的(de)(de)分支(zhi)，表明MYB122可能(neng)具有(you)限制炭疽(ju)(ju)菌(jun)活(huo)體營養生長的(de)(de)潛在(zai)功能(neng)（圖7E-F）。綜上(shang)所述(shu)，MYB122可能(neng)通過調(diao)(diao)控(kong)表皮(pi)(pi)細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)GSL相(xiang)關抗(kang)病代謝物的(de)(de)合成(cheng)調(diao)(diao)控(kong)植物抗(kang)病。

圖7. MYB122在真菌入侵點的表皮細胞中被特異誘(you)導表達(da)產生抗(kang)病效(xiao)應

文章繪制(zhi)了(le)炭疽菌(jun)侵(qin)染的(de)(de)(de)擬南芥葉片轉錄圖(tu)譜(pu)，涵(han)蓋了(le)葉片所有細(xi)胞(bao)類型(xing)，為研(yan)究(jiu)者提(ti)供鑒(jian)定細(xi)胞(bao)類型(xing)特異(yi)(yi)的(de)(de)(de)抗病(bing)反應提(ti)供了(le)寶(bao)貴的(de)(de)(de)數據集。作為察看基(ji)因表(biao)(biao)達模式(shi)的(de)(de)(de)工具(ju)，研(yan)究(jiu)者“批量”探究(jiu)了(le)免疫(yi)受體編碼基(ji)因的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達模式(shi)，發現(xian)很多NLRs在維(wei)管相關(guan)細(xi)胞(bao)中高(gao)表(biao)(biao)達。單(dan)細(xi)胞(bao)軌跡分析揭示了(le)不同空間位置(zhi)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)抗病(bing)反應，尤其是病(bing)菌(jun)入侵(qin)點氣(qi)孔保(bao)衛細(xi)胞(bao)通過(guo)激活ABA信(xin)號調控(kong)氣(qi)孔關(guan)閉以抵(di)抗病(bing)原菌(jun)的(de)(de)(de)進(jin)一步入侵(qin)。對照(zhao)組和病(bing)菌(jun)侵(qin)染組的(de)(de)(de)差異(yi)(yi)基(ji)因揭示新的(de)(de)(de)抗病(bing)調控(kong)基(ji)因—MYB122，為育種提(ti)供了(le)思(si)路。

派森諾(nuo)單細胞項目經驗

派(pai)森諾(nuo)生物具有豐富的(de)(de)單細(xi)胞項目經(jing)驗，涵蓋人、鼠、猴、雞、豬、羊、斑馬魚、團頭魴(fang)、鯽魚、鱖魚、蛙(wa)、蝌蚪(dou)、水稻(dao)、楊樹、小麥、玉米、苜(mu)蓿、大豆、棉花(hua)、番茄、煙(yan)草、南瓜(gua)、小青菜、胡(hu)蘿卜(bu)、川穹、檀香、蘆葦(wei)、油桃(tao)、石斛、人參(can)、牛至、金(jin)錢(qian)松、金(jin)銀(yin)花(hua)、桑(sang)葚、丹參(can)、工業大麻等(deng)模(mo)式(shi)及(ji)非模(mo)式(shi)物種(zhong)，涉及(ji)腫(zhong)瘤(liu)、肝臟、肺(fei)、角膜、視網(wang)膜、皮膚(fu)、胃黏(nian)膜、血管、血液、心臟、回(hui)腸(chang)、脛骨、睪丸、肌腱、胚(pei)胎、植物根、莖(jing)、葉、芽、花(hua)序、花(hua)藥、果實、種(zhong)子(zi)等(deng)多種(zhong)組織(zhi)類型，積累了豐富的(de)(de)細(xi)胞解(jie)離(li)和分析經(jing)驗，助力(li)更深(shen)、更廣的(de)(de)科(ke)研(yan)探索。