2024-04-01
前面我們在(zai)“”介紹了Visium CytAssist 的圖像類(lei)型(xing)。
在用Space Ranger 進行CytAssist 的(de)(de)基因(yin)表達分析時(shi)，需要(yao) CytAssist 載玻片上儀器生成的(de)(de)圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)以及標準載玻片上相同組(zu)織(zhi)切片的(de)(de)顯微鏡(jing)圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)(明場圖(tu)(tu)(tu))。Space Ranger使用自動圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)配準算法來(lai)對齊和優化兩(liang)個輸入圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)的(de)(de)疊(die)加。但是(shi)，對于熒光(guang)圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)，或者在基準標記物(wu)受阻或組(zu)織(zhi)邊(bian)界(jie)不清晰的(de)(de)情況下，需要(yao)手動配準圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)。
Loupe Browser提供用(yong)于(yu)手(shou)動圖(tu)像(xiang)配(pei)準的(de)指導，指導用(yong)戶上(shang)傳兩個圖(tu)像(xiang)、選擇圖(tu)像(xiang)之間的(de)關鍵地標點以及(ji)優化(hua)對(dui)齊(qi)方式、導出包含圖(tu)像(xiang)配(pei)準結(jie)果(guo)的(de)獨立對(dui)齊(qi)文件(jian)，或(huo)繼續使用(yong)Loupe Browser的(de)手(shou)動基準對(dui)齊(qi)流(liu)程生成組合對(dui)齊(qi)文件(jian)。
Loupe Browser8.0對(dui)齊(qi)頁(ye)面(mian)第(di)一部分(fen)手動基(ji)準(zhun)對(dui)齊(qi)和(he)組織選擇流程，第(di)二部分(fen)是(shi)(shi)CytAssist平臺的(de)CytAssist基(ji)準(zhun)圖和(he)顯微(wei)明場(chang)圖的(de)對(dui)齊(qi)流程，第(di)三部分(fen)是(shi)(shi)Visum HD圖像對(dui)齊(qi)的(de)流程"，介紹參(can)見""
今天我們主要(yao)介紹CytAssist的圖像對齊方法(fa)~
Step1、上(shang)傳圖像 兩個主要(yao)圖像輸入，即CytAssist儀器生(sheng)成(cheng)的圖像和顯微鏡圖像（明場圖)。CytAssist圖具有(you)基準框架，包(bao)含位置信息。明場圖的分辨率較(jiao)高，具有(you)比較(jiao)好的可視化(hua)效果(guo)，可用于后續(xu)分析(xi)。 上圖左邊(bian)上傳(chuan)CytAssist圖，右(you)邊(bian)可(ke)以(yi)上傳(chuan)明場(chang)圖或者熒(ying)光染色圖。上傳(chuan)成(cheng)功后(hou)點擊右(you)下(xia)角的"Next"按鈕。
Step2、地標選擇 因為后臺只知道(dao)CytAssist切(qie)片(pian)系列號的(de)空間方位和空間barcode位置(zhi)(zhi)等相關信息，如果后續要(yao)使用(yong)分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)更高的(de)明場(chang)圖(tu)，必須將CytAssist圖(tu)和明場(chang)圖(tu)的(de)位置(zhi)(zhi)進行對應，所以兩(liang)種圖(tu)對齊(qi)的(de)目的(de)是確定明場(chang)圖(tu)用(yong)于后續分(fen)(fen)析的(de)空間旋轉方向。 手(shou)動(dong)圖(tu)像(xiang)對齊的成功取決于兩個圖(tu)像(xiang)之間的準(zhun)確地標選(xuan)(xuan)擇。由于兩張圖(tu)像(xiang)的初始(shi)疊加是從地標位置開始(shi)的，因(yin)(yin)此選(xuan)(xuan)擇地標時需(xu)要考慮一些(xie)關鍵因(yin)(yin)素(su)： 1、為(wei)(wei)獲得最(zui)佳效果，建(jian)議每張(zhang)圖像選擇(ze)的(de)標記數量為(wei)(wei)為(wei)(wei) 5-8個(ge)。對于可以應(ying)用的(de)地標數量，沒(mei)有設置最(zui)大限制。如果放(fang)置的(de)地標少于三個(ge)，或者兩(liang)個(ge)圖像輸入之間的(de)地標數量不匹配，則無法(fa)單擊“Next”按鈕。 2、使用視覺(jue)上不(bu)同的邊緣(yuan)（內部(bu)和外部(bu)）以及特(te)征作(zuo)為地標的位(wei)置。兩(liang)幅圖像(xiang)共(gong)有的獨特(te)形態(tai)特(te)征造就了良好(hao)的地標位(wei)置。 3、標志之間的間距對(dui)于覆蓋組(zu)織(zhi)切片的整個區域也至(zhi)關(guan)重要。建議的做法是將地標分散到四個象限中的每一個象限。 4、避免在(zai)一(yi)條(tiao)直線上放置三個或更多地(di)標，這可能(neng)會(hui)干擾初始對齊算法。 5、10x 建議(yi)在每張圖(tu)像上使用縮(suo)放滑(hua)塊(上圖(tu)紅框圈出來(lai)的(de)(de)功(gong)能)，以獲得更精確的(de)(de)地標位(wei)置。當組(zu)織形(xing)狀(zhuang)均(jun)勻且(qie)形(xing)態特(te)征看(kan)起來(lai)光滑(hua)（即缺(que)乏(fa)明(ming)顯的(de)(de)可識別特(te)征）時，這尤其有用。 按照上述規則選擇好兩張圖對應的(de)標志后，點擊"Next"進入下一步。
Step3、評估對齊(qi)的質量(liang) 窗口中(zhong)(zhong)是兩個(ge)(ge)(ge)圖像(xiang)輸入的(de)重疊。對齊使用的(de)是Step2中(zhong)(zhong)選擇的(de)地標。右側提供(gong)了一(yi)個(ge)(ge)(ge)不透明(ming)度(du)滑塊(kuai)(kuai)，默認值(zhi)設置為(wei) 50%。要評估配準質量，可(ke)以(yi)放(fang)大圖像(xiang)并使用不透明(ming)度(du)滑塊(kuai)(kuai)向任一(yi)方向滾動，以(yi)檢查邊緣(yuan)之間的(de)重疊和兩個(ge)(ge)(ge)圖像(xiang)之間的(de)獨特組織特征。當(dang)一(yi)個(ge)(ge)(ge)圖像(xiang)相對于另(ling)一(yi)個(ge)(ge)(ge)圖像(xiang)沒有形狀不連(lian)續或(huo)偏移時，圖像(xiang)被視為(wei)已成(cheng)功對齊。 下圖(tu)上和(he)下分(fen)別為(wei)重疊(die)質量較(jiao)好以及重疊(die)質量一般的(de)(de)結果，可(ke)(ke)(ke)以看到(dao)，下面的(de)(de)圖(tu)中的(de)(de)陰影部分(fen)就是兩張(zhang)(zhang)圖(tu)未對(dui)齊區(qu)域(yu)，可(ke)(ke)(ke)能(neng)的(de)(de)原因是兩張(zhang)(zhang)圖(tu)的(de)(de)對(dui)齊標志(zhi)選(xuan)擇不(bu)合(he)理或者地標放(fang)置位置有些許偏移。也可(ke)(ke)(ke)以選(xuan)擇"自(zi)動(dong)較(jiao)準"，"自(zi)動(dong)較(jiao)準"時(shi)間比(bi)較(jiao)久也可(ke)(ke)(ke)能(neng)會失(shi)敗(bai)。 確認(ren)對齊后點擊(ji)"Next"進入(ru)下一步~
Step4、導出對(dui)齊(qi)結(jie)果文件(jian) CytAssist 圖(tu)(tu)像對(dui)(dui)齊流程的(de)(de)最后一步提供了(le)兩個(ge)選項(xiang)：1） 以 JSON 文件(jian)格式導出圖(tu)(tu)像配準(zhun)結果(guo)，或 2） 繼續手動(dong)基準(zhun)對(dui)(dui)齊，手動(dong)對(dui)(dui)齊分割組織切(qie)片(可以理解為選擇切(qie)片上的(de)(de)哪些(xie)區域是(shi)組織區域)并生(sheng)成組合的(de)(de) JSON 文件(jian)，如果(guo)計(ji)算(suan)服務器(qi)沒有聯網，該步驟是(shi)必須要進(jin)(jin)行的(de)(de)，如果(guo)計(ji)算(suan)服務器(qi)聯網了(le)，可以自動(dong)進(jin)(jin)行組織分割。 如果 CytAssist 圖像(xiang)組(zu)織(zhi)切(qie)(qie)片部分基(ji)準(zhun)框(kuang)遮(zhe)擋，或(huo)者邊(bian)緣被裁(cai)剪(jian)，則需要(yao)繼(ji)續(xu)手動(dong)(dong)基(ji)準(zhun)對齊工(gong)(gong)作流程。組(zu)織(zhi)染(ran)色(se)(se)的某些問題（弱染(ran)色(se)(se)、不完全(quan)染(ran)色(se)(se)或(huo)過度染(ran)色(se)(se)，組(zu)織(zhi)切(qie)(qie)片外滲漏）也會干擾使(shi)用自(zi)動(dong)(dong)圖像(xiang)處理管(guan)道準(zhun)確識別組(zu)織(zhi)相關spot。在(zai)這些情況下，建議完成手動(dong)(dong)基(ji)準(zhun)對齊工(gong)(gong)作流程。 假設我們的服務(wu)器沒有聯網，需要(yao)進行(xing)手動操(cao)作，這里導出json文件(jian)后可(ke)以點擊(ji)“Continue to manual fiducial alignment”，點擊(ji)后會(hui)自動上傳(chuan)剛剛處(chu)理的 CytAssist 圖像，直(zhi)接點擊(ji)"Next"進入(ru)下一(yi)步(bu)即可(ke)。
Step5、填入 CytAssist 序列號和捕獲(huo)區(qu)域(yu)，點擊(ji)"Next"
Step6、選擇 CytAssist 圖像的(de)基準框 該步的(de)目的(de)是調整(zheng)圖(tu)像(xiang)的(de)位(wei)置以和(he)spot文件上(shang)記(ji)錄的(de)各(ge)位(wei)置spot信息(xi)對(dui)(dui)應。對(dui)(dui)齊(qi)(qi)分兩個階段進行：粗粒度(du)(du)對(dui)(dui)齊(qi)(qi)和(he)細粒度(du)(du)對(dui)(dui)齊(qi)(qi)。在(zai)粗粒度(du)(du)對(dui)(dui)齊(qi)(qi)中(zhong)(zhong)，基準(zhun)標記(ji)的(de)中(zhong)(zhong)心被(bei)識別并用(yong)于對(dui)(dui)齊(qi)(qi)圖(tu)像(xiang)(按照下左(zuo)圖(tu)提供的(de)四(si)個形(xing)狀先后點擊CytAssist 圖(tu)中(zhong)(zhong)四(si)個角的(de)形(xing)狀)。在(zai)細粒度(du)(du)對(dui)(dui)齊(qi)(qi)中(zhong)(zhong)，可(ke)以通過拖動(dong)圖(tu)像(xiang)進行小的(de)調整(zheng)以更精確地(di)匹配(pei)點位(wei)置通過Adjust fiducials功能)。
Step7、手動選擇(ze)組織(zhi)區(qu)域 準確的(de)組織邊界選擇(ze)可(ke)產(chan)生更(geng)高質量的(de)數據，降低背景spot的(de)可(ke)能(neng)性(xing)，并為后續(xu)分析提(ti)供(gong)準確的(de)spot計(ji)數。圖像左側的(de)工具欄提(ti)供(gong)了(le)多種選項來執(zhi)行粗粒度和細(xi)粒度組織選擇(ze)。
Step8、導出(chu)組織區(qu)域的(de)json文件用于后續分析
整(zheng)個的(de)visium CytAssist 的(de)圖像(xiang)對齊(qi)工作就到此結束(shu)~
參考： 1、//www.10xgenomics.com/support/software/space-ranger/latest/analysis/inputs/image-fiducial-alignment 2、//www.10xgenomics.com/support/software/space-ranger/latest/analysis/inputs/image-cytassist-image-alignment
