隨著單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)測(ce)(ce)序(xu)技(ji)(ji)術的(de)(de)(de)(de)(de)(de)快(kuai)速發(fa)(fa)展，目(mu)前單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)組(zu)(zu)學(xue)已經(jing)覆(fu)蓋了(le)基因組(zu)(zu)、轉錄(lu)組(zu)(zu)、染色(se)質可及(ji)(ji)性(xing)(xing)、蛋白質組(zu)(zu)和其(qi)他表(biao)(biao)觀基因組(zu)(zu)。主流的(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)流控(kong)和微(wei)(wei)孔(kong)板(ban)體系顯著提(ti)高(gao)了(le)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)測(ce)(ce)序(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)通(tong)量。但微(wei)(wei)流控(kong)平(ping)臺(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)封閉性(xing)(xing)使(shi)(shi)得(de)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)(fen)隔(ge)之后很(hen)(hen)難進行一(yi)些復雜步驟(zou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)學(xue)技(ji)(ji)術。開放(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)裂池方(fang)法能夠靈(ling)活兼容(rong)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)組(zu)(zu)學(xue)技(ji)(ji)術，但在多(duo)(duo)輪混合-分(fen)(fen)散步驟(zou)中(zhong)會損(sun)失很(hen)(hen)多(duo)(duo)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，同(tong)時(shi)該(gai)(gai)技(ji)(ji)術對(dui)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)投入量要求較高(gao)，難以處(chu)理珍(zhen)貴樣本或細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)/細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核得(de)率低(di)(di)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)物種或組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)。此外，對(dui)于(yu)(yu)大多(duo)(duo)數(shu)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)檢(jian)測(ce)(ce)來說，靈(ling)敏(min)度(du)仍然(ran)是一(yi)個問題，例如許(xu)多(duo)(duo)基于(yu)(yu)寡(gua)核苷酸-dT的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法僅捕獲具有PolyA尾巴(ba)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)本，而沒(mei)有全長(chang)覆(fu)蓋；染色(se)質可及(ji)(ji)性(xing)(xing)分(fen)(fen)析的(de)(de)(de)(de)(de)(de)常(chang)用方(fang)法通(tong)常(chang)使(shi)(shi)用固定細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核，這可能導(dao)致(zhi)轉錄(lu)起始位點富集(ji)評(ping)分(fen)(fen)相對(dui)較低(di)(di)。為了(le)克服單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)測(ce)(ce)序(xu)中(zhong)3’端偏(pian)倚(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)局(ju)限性(xing)(xing)和對(dui)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)多(duo)(duo)組(zu)(zu)學(xue)技(ji)(ji)術的(de)(de)(de)(de)(de)(de)兼容(rong)性(xing)(xing)。2024年(nian)3月26日，浙江大學(xue)基礎醫學(xue)院郭(guo)國驥團(tuan)隊在Cell Discovery在線(xian)發(fa)(fa)表(biao)(biao)題為“Fast and flexible profiling of chromatin accessibility and total RNA expression in single nuclei using Microwell -seq3”的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)究論文，該(gai)(gai)研(yan)(yan)究提(ti)出了(le)新一(yi)代低(di)(di)成本、高(gao)通(tong)量、高(gao)兼容(rong)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)孔(kong)板(ban)平(ping)臺(tai)(Microwell -seq3)，用于(yu)(yu)高(gao)靈(ling)敏(min)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核染色(se)質可及(ji)(ji)性(xing)(xing)或全長(chang)轉錄(lu)組(zu)(zu)分(fen)(fen)析，系統比(bi)較了(le)該(gai)(gai)技(ji)(ji)術在全長(chang)轉錄(lu)組(zu)(zu)及(ji)(ji)染色(se)質可及(ji)(ji)性(xing)(xing)靈(ling)敏(min)度(du)提(ti)升(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)條件下(xia)，對(dui)小鼠的(de)(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)(duo)種組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)兼容(rong)性(xing)(xing)，并開展了(le)其(qi)快(kuai)速鑒(jian)定衰老(lao)自(zi)發(fa)(fa)腫瘤(liu)中(zhong)惡性(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)技(ji)(ji)術應用。

將(jiang)分(fen)離(li)后的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)分(fen)裝到不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)96孔(kong)板中(zhong)(zhong)(zhong)，用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)snRNA-seq或snATAC-seq。在snRNA-seq工作流程中(zhong)(zhong)(zhong)，將(jiang)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)分(fen)成多個(ge)96孔(kong)板，使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)帶(dai)有(you)(you)cell Barcode1和polyA尾(wei)巴的(de)(de)(de)(de)(de)隨機引(yin)物進(jin)行(xing)(xing)逆(ni)轉錄，以(yi)(yi)引(yin)入BGI平臺的(de)(de)(de)(de)(de)P7測序接(jie)頭和其(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)一條細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)條形(xing)碼(ma)cell Barcode1，使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)末端(duan)脫(tuo)氧核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)轉移酶(mei)(mei)對冗余(yu)寡核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)和polyA尾(wei)進(jin)行(xing)(xing)核(he)(he)酸(suan)外切酶(mei)(mei)處理后，將(jiang)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)合并用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)芯(xin)片加載，其(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)膠珠(zhu)上攜帶(dai)有(you)(you)用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)捕(bu)獲(huo)PolyA尾(wei)的(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)(he)苷(gan)(gan)酸(suan)-dT、cell Barcode2、UMI和BGI平臺的(de)(de)(de)(de)(de)P5測序接(jie)頭，用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)后續文庫構(gou)建(jian)。在snATAC-seq工作流程中(zhong)(zhong)(zhong)，使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)5’端(duan)帶(dai)有(you)(you)cell Barcode1、BGI平臺的(de)(de)(de)(de)(de)P7測序接(jie)頭和3’端(duan)帶(dai)有(you)(you)雜(za)交(jiao)連接(jie)序列的(de)(de)(de)(de)(de)Tn5轉座酶(mei)(mei)以(yi)(yi)標記染(ran)(ran)色質中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)開放區域。然后將(jiang)處理后的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)和攜帶(dai)有(you)(you)用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)捕(bu)獲(huo)3’端(duan)雜(za)交(jiao)連接(jie)尾(wei)巴、cell Barcode2、UMI和BGI平臺的(de)(de)(de)(de)(de)P5測序接(jie)頭混合并移液(ye)到微(wei)(wei)(wei)控芯(xin)片中(zhong)(zhong)(zhong)，用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)后續文庫構(gou)建(jian)(如圖(tu)1-a)。Microwell-seq3使(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)雙通(tong)可(ke)(ke)穿(chuan)透孔(kong)微(wei)(wei)(wei)孔(kong)芯(xin)片并不(bu)完全依賴重力和泊松(song)分(fen)布，而是通(tong)過毛細(xi)(xi)(xi)(xi)作用(yong)(yong)(yong)(yong)均勻的(de)(de)(de)(de)(de)捕(bu)獲(huo)流經表(biao)面含有(you)(you)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)與微(wei)(wei)(wei)珠(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)體，避(bi)免了(le)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)浪費。置(zhi)于(yu)PCR管中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)孔(kong)芯(xin)片，每一輪反(fan)應都可(ke)(ke)在需要的(de)(de)(de)(de)(de)溫度下孵育，而芯(xin)片表(biao)面的(de)(de)(de)(de)(de)油封可(ke)(ke)有(you)(you)效防(fang)止擴增步驟中(zhong)(zhong)(zhong)可(ke)(ke)能出現的(de)(de)(de)(de)(de)交(jiao)叉(cha)污染(ran)(ran)。除此(ci)之外可(ke)(ke)通(tong)過后續數據分(fen)區分(fen)含有(you)(you)多個(ge)微(wei)(wei)(wei)珠(zhu)或多個(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)的(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)孔(kong)。

圖(tu)1 Microwell-seq3技術原(yuan)理(li)圖(tu)和(he)性能驗證(zheng)

Microwell-seq3的(de)(de)(de)(de)(de)人鼠(shu)(shu)混(hun)合細胞(bao)(bao)實驗(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)數據(ju)表明(ming)，圍繞TSS(ATAC-seq)和(he)(he)轉(zhuan)錄(lu)終(zhong)止位點(dian)(TTS)(RNA-seq)的(de)(de)(de)(de)(de)全基(ji)(ji)(ji)因組(zu)讀取(qu)信號(hao)，Microwell-seq3與10X Genomics、VASA-seq和(he)(he)Smart-seq-total等(deng)全長(chang)scRNA-seq方(fang)法顯示出相(xiang)似的(de)(de)(de)(de)(de)區域(yu)富集(ji)(ji)譜(pu)(圖(tu)1-b)。使用Microwell-seq3進(jin)行染色(se)質可及性分(fen)析產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)TSS評分(fen)高于使用10X Genomics獲得的(de)(de)(de)(de)(de)TSS評分(fen)(圖(tu)1-c)。在(zai)snRNA-seq中，與之前的(de)(de)(de)(de)(de)版本和(he)(he)其他方(fang)法相(xiang)比(bi)，Microwell-seq3的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因檢測能力有(you)所提(ti)高(圖(tu)1-d)。除(chu)此之外，Microwell-seq3、FLASH和(he)(he)VASA-seq在(zai)整個基(ji)(ji)(ji)因長(chang)度上(shang)均有(you)均勻的(de)(de)(de)(de)(de)覆蓋率，其他方(fang)法分(fen)別顯示偏向轉(zhuan)錄(lu)本的(de)(de)(de)(de)(de)5’端和(he)(he)3’端(圖(tu)1-e)。而且Microwell-seq3檢測的(de)(de)(de)(de)(de)數據(ju)中除(chu)mRNA外，還含有(you)9.3%的(de)(de)(de)(de)(de)lncRNA(圖(tu)1-f)。最(zui)后研(yan)究者(zhe)進(jin)一(yi)步收集(ji)(ji)了(le)多(duo)種成(cheng)年(nian)小(xiao)鼠(shu)(shu)組(zu)織(zhi)，通過Microwell-seq3生(sheng)成(cheng)了(le)單細胞(bao)(bao)總RNA和(he)(he)染色(se)質可及性圖(tu)譜(pu)，涵蓋了(le)各組(zu)織(zhi)中的(de)(de)(de)(de)(de)主要細胞(bao)(bao)類型，并聯合RNA-seq和(he)(he)ATAC-seq基(ji)(ji)(ji)因調(diao)控網絡，富集(ji)(ji)了(le)大腦(nao)中主要細胞(bao)(bao)類型中的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)控因子，提(ti)示多(duo)組(zu)學(xue)數據(ju)的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)控網絡比(bi)單一(yi)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)能夠提(ti)供更多(duo)信息。成(cheng)年(nian)小(xiao)鼠(shu)(shu)細胞(bao)(bao)總RNA與染色(se)質開放圖(tu)譜(pu)的(de)(de)(de)(de)(de)繪制也展(zhan)示了(le)Microwell-seq3的(de)(de)(de)(de)(de)優秀性能和(he)(he)對各組(zu)織(zhi)類型細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)兼容(rong)性。

為了探(tan)索(suo)Microwell-seq3可以(yi)應用輔助的(de)(de)(de)臨床診(zhen)斷場景，研究嘗試采(cai)用Microwell-seq3鑒定老年小鼠自發(fa)性(xing)(xing)肺(fei)(fei)(fei)腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)惡(e)性(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(圖(tu)(tu)2-a)。整(zheng)合了肺(fei)(fei)(fei)腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)、腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)鄰近(jin)組織(zhi)及(ji)正(zheng)常(chang)肺(fei)(fei)(fei)組織(zhi)的(de)(de)(de)染(ran)色質可及(ji)性(xing)(xing)數(shu)據揭示了一(yi)套全面的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類型，包含肺(fei)(fei)(fei)泡I型細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(AT1)、肺(fei)(fei)(fei)泡II型細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(AT2)、B細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)等細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，同時(shi)也鑒定到一(yi)群特征介于肺(fei)(fei)(fei)泡上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和間質細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)之間的(de)(de)(de)腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)惡(e)性(xing)(xing)上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(圖(tu)(tu)2-b、c)。腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)特異性(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)亞(ya)群中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)ATAC-seq信號顯示在(zai)(zai)(zai)特定染(ran)色體區域拷貝(bei)數(shu)擴(kuo)增(zeng)或(huo)缺(que)失(shi)的(de)(de)(de)惡(e)性(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)(zai)(zai)腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)和腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)鄰近(jin)組織(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)富集(ji)(圖(tu)(tu)2-d)。通過分(fen)析(xi)惡(e)性(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)激活的(de)(de)(de)轉錄因(yin)(yin)(yin)子及(ji)其(qi)調(diao)(diao)控(kong)的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)網(wang)絡發(fa)現腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)和腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)鄰近(jin)組織(zhi)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)(biao)現出Foxc2(調(diao)(diao)控(kong)上(shang)皮(pi)-間質轉化過程)、Nkx3-1(調(diao)(diao)節轉移過程中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)移行惡(e)性(xing)(xing)上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)干性(xing)(xing))、Foxm1、Nkx2-1、Tp63和Zeb1的(de)(de)(de)高(gao)表(biao)(biao)達，而Tp53在(zai)(zai)(zai)正(zheng)常(chang)組織(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達較高(gao)，以(yi)上(shang)結果表(biao)(biao)明(ming)自發(fa)性(xing)(xing)肺(fei)(fei)(fei)腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)的(de)(de)(de)惡(e)性(xing)(xing)上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)(biao)現出一(yi)定干性(xing)(xing)特征，Tp63、Nkx2-1等靶點的(de)(de)(de)富集(ji)表(biao)(biao)明(ming)該肺(fei)(fei)(fei)部腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)符合肺(fei)(fei)(fei)腺鱗癌的(de)(de)(de)分(fen)子特征，部分(fen)調(diao)(diao)控(kong)基(ji)因(yin)(yin)(yin)在(zai)(zai)(zai)免疫組化中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)得到了驗證，表(biao)(biao)明(ming)Microwell-seq3在(zai)(zai)(zai)能輔助病理診(zhen)斷的(de)(de)(de)情況下，可以(yi)在(zai)(zai)(zai)單細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)基(ji)因(yin)(yin)(yin)調(diao)(diao)控(kong)層面提(ti)供更多的(de)(de)(de)惡(e)性(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)潛在(zai)(zai)(zai)靶點信息及(ji)其(qi)互(hu)作模式(圖(tu)(tu)2-e、f、g)。

圖2 老年(nian)小鼠自發(fa)性肺腫(zhong)瘤分析