2024-04-16
作為單細(xi)(xi)胞高級分(fen)(fen)(fen)析(xi)之一(yi)的(de)擬時(shi)(shi)(shi)軌跡分(fen)(fen)(fen)析(xi)，在(zai)進行(xing)細(xi)(xi)胞動態發(fa)育，或者細(xi)(xi)胞狀(zhuang)態分(fen)(fen)(fen)化過程(cheng)研究中，利用(yong)擬時(shi)(shi)(shi)軌跡分(fen)(fen)(fen)析(xi)可模擬細(xi)(xi)胞動態過程(cheng)，獲得(de)細(xi)(xi)胞發(fa)育的(de)方向以及狀(zhuang)態，同時(shi)(shi)(shi)也有(you)助于獲得(de)處(chu)于中間態的(de)細(xi)(xi)胞類(lei)型(xing)。常見的(de)有(you)monocle擬時(shi)(shi)(shi)序(xu)分(fen)(fen)(fen)析(xi)、RNA velocity細(xi)(xi)胞速率、Palantir擬時(shi)(shi)(shi)序(xu)分(fen)(fen)(fen)析(xi)、CytoTRACE細(xi)(xi)胞分(fen)(fen)(fen)化潛能、PAGA軌跡推(tui)斷等(deng)，下面隨小派看(kan)看(kan)擬時(shi)(shi)(shi)軌跡分(fen)(fen)(fen)析(xi)在(zai)單細(xi)(xi)胞研究中的(de)應用(yong)思路吧~
應用1、挖掘細胞分化的(de)關鍵調控(kong)基因 項目文章：Single-cell transcriptomes and runx2b-/- mutants reveal the genetic signatures of intermuscular bone formation in zebrafish 發表(biao)期刊：National Science Review（IF：20.6） 科學問題：魚類肌間刺是(shi)如何形成的(de)？關鍵(jian)的(de)調(diao)控基因有哪些？ 擬時軌跡分(fen)析流程及結果描述： Step 1:鑒(jian)(jian)定肌肉組(zu)(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)類型(xing)：取 60dpf 野生型(xing)斑馬魚的尾部肌肉組(zu)(zu)織(zhi)，解(jie)離單細(xi)胞(bao)，進行(xing)單細(xi)胞(bao)轉錄組(zu)(zu)測序(xu)，根據經典marker基因表(biao)達鑒(jian)(jian)定到18類細(xi)胞(bao)（圖A）。 Step 2: 挑選(xuan)與(yu)肌(ji)(ji)間刺形成相關(guan)(guan)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)群：根據已(yi)有(you)的研究報道, 成骨細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和肌(ji)(ji)腱(jian)相關(guan)(guan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)群（肌(ji)(ji)腱(jian)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、成熟肌(ji)(ji)腱(jian)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、分(fen)化(hua)中肌(ji)(ji)腱(jian)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao) ）與(yu)肌(ji)(ji)間刺形成具有(you)潛(qian)在的分(fen)化(hua)關(guan)(guan)系，利用擬時(shi)序分(fen)析算法之一monocle2對這4類細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行擬時(shi)序分(fen)析,發現4類細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)別(bie)排列在擬時(shi)序軌(gui)跡的的不同(tong)位(wei)置：肌(ji)(ji)腱(jian)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)位(wei)于分(fen)化(hua)起點，分(fen)化(hua)中肌(ji)(ji)腱(jian)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)位(wei)于中間，而成骨細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和成熟肌(ji)(ji)腱(jian)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)別(bie)位(wei)于2個分(fen)化(hua)末(mo)端。 Step 3: 獲(huo)(huo)得分化(hua)軌跡(ji)中動態變(bian)(bian)化(hua)的(de)(de)基(ji)因(yin)集(ji)：以(yi)肌(ji)腱祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)為起始(shi)點，獲(huo)(huo)得細(xi)(xi)(xi)胞(bao)向兩個方向分化(hua)時的(de)(de)基(ji)因(yin)動態變(bian)(bian)化(hua)熱圖(tu)，一共(gong)獲(huo)(huo)得3個具有不同表(biao)(biao)達(da)變(bian)(bian)化(hua)趨勢的(de)(de)模(mo)塊基(ji)因(yin)，從這三個模(mo)塊基(ji)因(yin)集(ji)中共(gong)鑒定到10個可能與肌(ji)間刺形(xing)成(cheng)相關(guan)的(de)(de)基(ji)因(yin)：其中7個基(ji)因(yin)（ runx2a, runx2b, bmp2a, scpp1, spp1, entpd5a, entpd5b ）的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)在(zai)肌(ji)腱祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中表(biao)(biao)達(da)低(di)，而在(zai)成(cheng)骨(gu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中表(biao)(biao)達(da)高，3個基(ji)因(yin)（sost, sox11b, ccn4b）在(zai)肌(ji)腱祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中高表(biao)(biao)達(da)，而在(zai)成(cheng)骨(gu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和成(cheng)熟肌(ji)腱細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中表(biao)(biao)達(da)較(jiao)低(di)。 基(ji)因功能驗證：在(zai)斑馬(ma)魚(yu)中利(li)用CRISPR-Cas9方法對(dui)這10個基(ji)因分別(bie)進行敲除，發現entpd5a-/-(40dpf)和(he)runx2b-/-突變(bian)(bian)體(ti)完全缺乏肌間(jian)刺的(de)(de)形成(cheng)。其中entpd5a-/-突變(bian)(bian)體(ti)在(zai)40dpf時死亡，runx2b-/-突變(bian)(bian)體(ti)正常存活，該基(ji)因的(de)(de)鑒定為生產無肌間(jian)刺的(de)(de)商業魚(yu)類品種奠(dian)定基(ji)礎。
應(ying)用2、判斷Novel細(xi)胞類型的發育狀態(tai) 文獻(xian)：Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease 發(fa)表期刊：Science （IF：56.9） 科學問(wen)題：腎臟組(zu)織(zhi)包含哪些細胞(bao)類型？以及它們的(de)功能(neng)？ 擬時軌跡(ji)分析流程及結果描述(shu)： Step 1:鑒(jian)定腎臟組(zu)(zu)織(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)類型：取(qu)7例(li)健康小(xiao)鼠完整腎組(zu)(zu)織(zhi)，解離單細(xi)(xi)胞(bao)，進(jin)行單細(xi)(xi)胞(bao)轉錄組(zu)(zu)測序，根據經(jing)典marker基因表達鑒(jian)定到17類細(xi)(xi)胞(bao)，其中一類細(xi)(xi)胞(bao)（cluster 8）具有獨特的轉錄特征：同時表達兩類細(xi)(xi)胞(bao)（主細(xi)(xi)胞(bao)和閏細(xi)(xi)胞(bao)）的marker基因，并且具有特異表達的基因，為了(le)進(jin)一步(bu)研究該細(xi)(xi)胞(bao)類型（圖A）。 Step 2: 挑選(xuan)與cluster 8相關的細(xi)(xi)胞(bao)群，利用擬時序分析算法monocle2對cluster6, 主(zhu)細(xi)(xi)胞(bao)（PC）, 閏細(xi)(xi)胞(bao)（IC）這3類(lei)細(xi)(xi)胞(bao)進(jin)行擬時序分析,發現(xian)cluster8位于(yu)主(zhu)細(xi)(xi)胞(bao)和閏細(xi)(xi)胞(bao)的中間(jian)位置，表明cluster8是一類(lei)過渡(du)態細(xi)(xi)胞(bao)； 擬時序結果驗證(zheng)：構建(jian)譜系標簽小鼠Aqp2CremT/mG和(he)Aqp2CremT/mG，分(fen)別標記分(fen)化中的主細(xi)胞(bao)(bao)和(he)閏細(xi)胞(bao)(bao)，多重免(mian)疫熒(ying)光染(ran)色(se)發(fa)現(xian)存在(zai)一(yi)類細(xi)胞(bao)(bao)是AQP2和(he)ATP6V1B1“雙陽性”細(xi)胞(bao)(bao)，與(yu)單細(xi)胞(bao)(bao)研究結果吻(wen)合(he)。
應用(yong)3 輔助(zhu)判(pan)斷細胞注釋的準(zhun)確度 文獻：Single-cell transcriptome analysis reveals aberrant stromal cells and heterogeneous endothelial cells in alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head 發表期刊：Communications Biology （IF：5.9） 科學問題：探究中期(qi)和晚期(qi)股(gu)骨頭(tou)壞死（ONFH）患者(zhe)股(gu)骨組(zu)織的轉(zhuan)錄圖譜(pu)。 擬時軌(gui)跡(ji)分析流程及(ji)結果描述： Step 1:鑒定股(gu)骨(gu)組(zu)(zu)織(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型：取患(huan)者和健康對(dui)照組(zu)(zu)的(de)股(gu)骨(gu)組(zu)(zu)織(zhi)，解離(li)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，進(jin)行單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)測序，根據(ju)經(jing)典marker基(ji)因(yin)表達鑒定到4大類細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)—髓系(xi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、淋巴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、內皮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、基(ji)質細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，其中基(ji)質細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)包含(han)5個亞(ya)群：未分化的(de)基(ji)質細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（USCs）、纖維軟(ruan)骨(gu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（FCs）、成(cheng)脂譜(pu)(pu)系(xi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（ALCs）、成(cheng)骨(gu)譜(pu)(pu)系(xi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（OLCs）、軟(ruan)骨(gu)譜(pu)(pu)系(xi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（CLCs）,其中一(yi)些亞(ya)群的(de)特征基(ji)因(yin)呈現(xian)出非特異的(de)表達。 Step 2: 挑選感興(xing)趣的(de)細(xi)胞(bao)(bao)亞群：為(wei)了證(zheng)實(shi)上一步(bu)中(zhong)基(ji)于(yu)marker基(ji)因對基(ji)質(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)亞群注釋的(de)準確性(xing)，利用擬時序分(fen)(fen)(fen)析(xi)算(suan)法monocle2對基(ji)質(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)5個亞群進行擬時序分(fen)(fen)(fen)析(xi)，發現未分(fen)(fen)(fen)化的(de)基(ji)質(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)（USCs）位(wei)于(yu)擬時軌(gui)跡的(de)分(fen)(fen)(fen)化起點(dian)，經歷2次(ci)細(xi)胞(bao)(bao)命運(yun)的(de)轉變分(fen)(fen)(fen)別(bie)形成脂肪(fang)、成骨(gu)和軟骨(gu)。用于(yu)判(pan)定細(xi)胞(bao)(bao)亞群的(de)marker基(ji)因表達峰(feng)值出(chu)現在擬時軌(gui)跡的(de)不同位(wei)置，與細(xi)胞(bao)(bao)命運(yun)的(de)判(pan)定是一致的(de)。 Step 3: 獲得(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)化軌跡中動態變(bian)化的(de)(de)基(ji)因集(ji)(ji)：分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)以擬(ni)時軌跡中的(de)(de)2個分(fen)(fen)(fen)(fen)支點(dian)(dian)為中心，獲得(de)隨著(zhu)分(fen)(fen)(fen)(fen)支點(dian)(dian)細(xi)胞(bao)向不(bu)同方向分(fen)(fen)(fen)(fen)化時呈現出不(bu)同表(biao)達趨勢的(de)(de)基(ji)因集(ji)(ji)，發現已知的(de)(de)譜(pu)系特異性基(ji)因(ADIRF, IBSP, SPP1)表(biao)達趨勢與細(xi)胞(bao)命運一致，進一步證實了(le)細(xi)胞(bao)注(zhu)釋(shi)的(de)(de)準確性。
