2024-04-22
隨(sui)著進入后基因組(zu)時代，高(gao)(gao)通(tong)量(liang)測序(xu)方法和平臺日(ri)趨完善，數(shu)據準確度顯著提升，應(ying)用廣泛。對(dui)樣本(ben)進行高(gao)(gao)通(tong)量(liang)測序(xu)和生信(xin)分(fen)析，可以同時獲(huo)得STR、SNP、Indel和mRNA等各種(zhong)類型(xing)的分(fen)子遺傳標記(ji)信(xin)息。
目前，SNP（單核苷酸(suan)多態性）已成為當(dang)下熱門研究(jiu)課題(ti)之一，其應用非常(chang)廣泛。農業領域，能(neng)夠進行性狀基因的精細定(ding)位、分子輔助育種、種子資源鑒定(ding)等；在(zai)醫(yi)學領域，可進行疾病的分子遺(yi)傳機制研究(jiu)、疾病基因定(ding)位、藥物敏感或(huo)疾病易感性位點篩選等。
傳統的(de)SNP位點篩(shai)選的(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)，包括一代直(zhi)接測序法(fa)(fa)、SNaPshot法(fa)(fa)、LDR法(fa)(fa)、TaqMan探針法(fa)(fa)等，這些方(fang)(fang)法(fa)(fa)無論是(shi)成本，還是(shi)通量、周(zhou)期，都無法(fa)(fa)滿足越(yue)來越(yue)高的(de)市場(chang)要求(qiu)。那么有沒有一種集通量、速(su)度(du)、成本及精確于一身的(de)SNP檢(jian)測方(fang)(fang)法(fa)(fa)？
KASP技(ji)(ji)術(shu)自面(mian)世以(yi)來，以(yi)其超高的靈活性、準確(que)度和性價比(bi)，被業內稱為(wei)“基(ji)因分型(xing)研究者指尖跳躍的珠(zhu)鏈”。如何使用Kasp技(ji)(ji)術(shu)進行基(ji)因分型(xing)，今天(tian)我們就(jiu)一(yi)起來看看吧(ba)！
一、Kasp技(ji)術介紹 KASP? 是指(zhi)競爭性(xing)(xing)等位(wei)基因特異性(xing)(xing) PCR (Kompetitive Allele Speci?c PCR)，可對廣泛的(de)(de)基因組 DNA 樣(yang)品(pin)，包(bao)括復雜基因組 DNA 樣(yang)品(pin)，對目標(biao) SNPs 和 InDels 進行精準(zhun)的(de)(de)雙等位(wei)基因分型。 KASP技術不需要針(zhen)對每個(ge)SNP位(wei)點(dian)都(dou)去合成(cheng)(cheng)(cheng)特(te)異的熒(ying)光(guang)引物，它基于(yu)自己獨特(te)的ARM PCR原(yuan)理，讓所(suo)有的位(wei)點(dian)檢(jian)測(ce)最終都(dou)使用通(tong)用熒(ying)光(guang)引物擴增，這大大降低了LGC KASP的試(shi)劑成(cheng)(cheng)(cheng)本(ben)，既有金(jin)標(biao)準的準確(que)，又降低了使用成(cheng)(cheng)(cheng)本(ben)，比Taqman還具有更好的位(wei)點(dian)適應(ying)性，所(suo)以在醫學(xue)、農學(xue)檢(jian)測(ce)方(fang)面(mian)LGC KASP都(dou)有非常好的應(ying)用。 Kasp反應體系包(bao)括KASP Assay mix、KASP Master mix以及DNA模版。 KASP Assay mix：KASP引物(wu)(wu)混合物(wu)(wu)，含有根據要分型的SNP位點所設(she)計(ji)的帶有兩(liang)個不同的獨特接頭序列(lie)（5’端）的競(jing)爭(zheng)性等位基(ji)因特異性（3’端）正向引物(wu)(wu)，以(yi)及一(yi)個共用反向引物(wu)(wu)。 KASP Master mix：KASP主反應混合物，含有FRET試(shi)劑盒(he)和Taq聚合酶。 DNA模版(ban)：帶有目標SNP的待測DNA樣本。 二、Kasp反應流(liu)程 第一輪反應：DNA模版變性(xing)，等位基(ji)因特(te)異性(xing)引物與DNA模版的(de)SNP位點配對并延伸(shen)，與通(tong)用反向引物一起(qi)擴增(zeng)目的(de)片段。 第二輪反(fan)應：等位基因(yin)特異性接(jie)頭序列(lie)的擴增 在第二輪反應中，反向引物(wu)結合、延伸并(bing)對等位(wei)基因的(de)特異(yi)性接頭(tou)（下(xia)圖(tu)紅顏色的(de)序列(lie)(lie)）序列(lie)(lie)進行擴增，即紅顏色的(de)序列(lie)(lie)會(hui)引入到(dao)SNP位(wei)點對應的(de)PCR產物(wu)中。 第三輪(lun)反應(ying)：產生熒光信號 以新合成的含有特異(yi)性接頭的序列為模版，熒(ying)(ying)光(guang)標記的通用探針與接頭序列配對并延(yan)伸，從淬滅基(ji)團中釋放出(chu)熒(ying)(ying)光(guang)，產生熒(ying)(ying)光(guang)信號。隨著PCR循(xun)環數的提升，帶有熒(ying)(ying)光(guang)信號的PCR產物累積(ji)，熒(ying)(ying)光(guang)信號加強，在反應結束后讀取熒(ying)(ying)光(guang)數據。 三、Kasp技術(shu)的優(you)勢(shi) 1、分型結果準確（準確度>99.8%） 2、檢測(ce)成本低 3、樣本用量低 4、檢測周期短 5、檢測通量高 四、Kasp結果呈(cheng)現 Kasp基因(yin)分型(xing)技術的(de)結果(guo)(guo)為三個(ge)清晰(xi)的(de)基因(yin)分型(xing)散點圖(tu)。以圖(tu)中結果(guo)(guo)為例，FAM 基因(yin)型(xing)位于 X 軸（藍(lan)色(se)的(de)數據(ju)(ju)(ju)點），HEX 基因(yin)型(xing)位于 Y 軸（紅(hong)色(se)的(de)數據(ju)(ju)(ju)點）， 綠色(se)的(de)數據(ju)(ju)(ju)點代(dai)表雜(za)合基因(yin)型(xing)，黑色(se)的(de)數據(ju)(ju)(ju)點是(shi)陰性對(dui)(dui)照(zhao)(NTCs)。96 孔板的(de)排(pai)布(bu)顯示的(de)是(shi)每個(ge)樣本DNA對(dui)(dui)應的(de)基因(yin)型(xing)結果(guo)(guo)。 同時我們(men)也會提供具體分型(xing)信息(xi)哦！如(ru)下表(biao)所(suo)示(shi) 1 C:C 10 C:C 19 C:T 28 T:T 37 C:C 2 C:C 11 C:C 20 C:T 29 C:C 38 C:C 3 C:C 12 C:C 21 C:T 30 T:C 39 T:C 4 C:T 13 C:T 22 C:T 31 C:C 40 C:C 5 C:C 14 C:C 23 T:T 32 T:T 41 C:C 6 C:C 15 C:C 24 T:T 33 T:C 42 C:C 7 C:C 16 C:C 25 C:T 34 T:C 43 T:T 8 T:T 17 T:T 26 C:T 35 C:C 44 T:C 9 C:C 18 C:C 27 C:T 36 T:C 45 C:C 五、Kasp的應用 Kasp技術基(ji)(ji)于(yu)引(yin)物(wu)3’末端(duan)堿基(ji)(ji)的(de)特(te)異(yi)匹(pi)配來對SNP進(jin)行分(fen)型(xing)，根據終端(duan)熒光的(de)顏色(se)進(jin)行判斷。每孔采用雙色(se)熒光檢(jian)測一(yi)個(ge)樣本的(de)一(yi)個(ge)SNP位(wei)點的(de)可能基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)型(xing)，不同SNP基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)型(xing)對應(ying)不同的(de)熒光產(chan)物(wu)。特(te)別適用于(yu)高通量測序后的(de)SNP驗(yan)證(zheng)、大(da)樣本量少(shao)SNP的(de)驗(yan)證(zheng)，廣泛(fan)應(ying)用于(yu)作(zuo)物(wu)和動物(wu)育(yu)種、人類(lei)遺(yi)傳病檢(jian)測、藥物(wu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組學、疾病易感性(xing)檢(jian)測QTL精細定位(wei)、種子質量控(kong)制、大(da)樣本量的(de)分(fen)子標記(ji)驗(yan)證(zheng)、分(fen)子輔助育(yu)種、種子資(zi)源鑒(jian)定等。 小伙(huo)伴們(men)，有大樣本量的(de)SNP的(de)驗證(zheng)，推薦(jian)使(shi)用(yong)Kasp技術哦！
