2024-04-27
相較于傳(chuan)統bulk測序，單細胞測序最重要的(de)功能(neng)就是能(neng)在(zai)單個細胞水平(ping)上分析異質性(xing)，對(dui)于經常發(fa)現基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)變(bian)異（如(ru)突變(bian)、相位(wei)變(bian)異、基(ji)(ji)因(yin)(yin)缺失、基(ji)(ji)因(yin)(yin)復制和水平(ping)基(ji)(ji)因(yin)(yin)轉(zhuan)移(yi)）的(de)抗菌素耐藥(yao)性(xing)、宿主定植及發(fa)病機制中，單細胞基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)異質性(xing)分析起關(guan)鍵性(xing)作用。同時(shi)，在(zai)單細胞水平(ping)上研究微生(sheng)物(wu)，不僅可(ke)以(yi)檢(jian)測不可(ke)培養的(de)微生(sheng)物(wu)，而且可(ke)以(yi)更(geng)多的(de)檢(jian)測到罕見變(bian)異，可(ke)以(yi)更(geng)深入了解它(ta)們在(zai)復雜(za)的(de)多物(wu)種(zhong)群(qun)落中自然(ran)存在(zai)的(de)個體功能(neng)。
目前(qian)，使用微生物(wu)(wu)進行單(dan)(dan)細胞測序也存在(zai)一定(ding)(ding)挑戰(zhan)，首先是(shi)(shi)微生物(wu)(wu)本身(shen)mRNA豐度低、轉(zhuan)錄本不(bu)穩(wen)定(ding)(ding)、體積(ji)小、胞膜和細胞壁裂(lie)解條件特(te)異性(xing)強，導致單(dan)(dan)細胞測序方法需(xu)要復雜的工(gong)作流程(cheng)。其次是(shi)(shi)液滴微流控(kong)技術，目前(qian)商(shang)業化(hua)的微流控(kong)技術不(bu)僅價格昂貴而且需(xu)要專業知識(shi)，存在(zai)一定(ding)(ding)局限(xian)性(xing)，因此(ci)需(xu)要一種易(yi)于(yu)獲(huo)取和可推廣的工(gong)具來分析微生物(wu)(wu)群(qun)體內的遺傳異質性(xing)。
2024年(nian)1月(yue)7日來自威斯康(kang)星大學麥迪遜(xun)分(fen)(fen)校(xiao)的(de)(de)Freeman Lan?研究團隊在(zai)Nature Methods期刊上發表(biao)了一篇(pian)Massively parallel single-cell sequencing of diverse microbial populations的(de)(de)研究文章(zhang)，文中(zhong)介紹(shao)了一種用(yong)于定量的(de)(de)微(wei)生(sheng)物單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)靶向(xiang)(xiang)遺傳分(fen)(fen)析——液滴的(de)(de)擴增(zeng)子靶向(xiang)(xiang)測(ce)序（droplet targeted amplicon sequencing，DoTA-seq）。DoTA-seq利用(yong)水凝膠，使(shi)用(yong)簡單(dan)(dan)(dan)的(de)(de)液滴制造器分(fen)(fen)離和裂解單(dan)(dan)(dan)個微(wei)生(sheng)物細(xi)(xi)胞(bao)。接下來，一步靶向(xiang)(xiang)多(duo)重PCR反應(ying)同時擴增(zeng)目(mu)標DNA并將(jiang)獨特的(de)(de)DNA Barcode附著在(zai)每個細(xi)(xi)胞(bao)上，最終生(sheng)成用(yong)于測(ce)序的(de)(de)單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)基因(yin)(yin)組(zu)文庫。與(yu)之前發表(biao)的(de)(de)單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)非(fei)靶向(xiang)(xiang)測(ce)序的(de)(de)液滴測(ce)序工作流程相比，DoTA-seq的(de)(de)靶向(xiang)(xiang)性使(shi)得感(gan)興趣(qu)的(de)(de)基因(yin)(yin)座(zuo)的(de)(de)捕獲率很高，適用(yong)于已(yi)知感(gan)興趣(qu)基因(yin)(yin)座(zuo)的(de)(de)單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)測(ce)序分(fen)(fen)析，是(shi)一種在(zai)單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)分(fen)(fen)辨率下研究微(wei)生(sheng)物基因(yin)(yin)組(zu)的(de)(de)強大且可推(tui)廣的(de)(de)方法。
接下來(lai)，帶大家解析這篇(pian)文章：
技術原理(li) 圖1 DoTA-seq工作流程的概述 在(zai)(zai)DoTA-seq中(zhong)(zhong)，作(zuo)(zuo)者通(tong)過微流(liu)體液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)制(zhi)(zhi)造(zao)器(qi)將(jiang)單(dan)個(ge)細菌細胞封裝(zhuang)到含(han)有(you)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)和(he)可逆交(jiao)聯劑的(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)凝(ning)膠(jiao)中(zhong)(zhong)（圖(tu)1a），交(jiao)聯聚丙(bing)烯酰(xian)胺(an)不僅耐(nai)熱，而且聚丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝(ning)膠(jiao)基(ji)質包(bao)含(han)10-100nm的(de)孔隙，可以使清(qing)洗劑和(he)酶擴(kuo)散通(tong)過，裂(lie)解(jie)細胞并去(qu)除細胞質，同時包(bao)裹基(ji)因組和(he)質粒DNA（圖(tu)1b），在(zai)(zai)極限稀釋下，根據泊松分布，大約(yue)十分之一(yi)的(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)凝(ning)膠(jiao)將(jiang)包(bao)含(han)一(yi)個(ge)細胞，液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)制(zhi)(zhi)造(zao)器(qi)可以在(zai)(zai)幾(ji)分鐘內封裝(zhuang)數十萬個(ge)單(dan)個(ge)細胞。液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)凝(ning)膠(jiao)內的(de)細胞裂(lie)解(jie)后，作(zuo)(zuo)者使用(yong)第二個(ge)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)制(zhi)(zhi)造(zao)器(qi)將(jiang)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)凝(ning)膠(jiao)與PCR試劑和(he)隨機合成的(de)DNA Barcode寡(gua)核苷酸一(yi)起重新封裝(zhuang)，形(xing)成一(yi)個(ge)更大的(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)（圖(tu)1c）。在(zai)(zai)含(han)有(you)裂(lie)解(jie)細胞和(he)Barcode的(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)中(zhong)(zhong)，通(tong)過兩輪PCR，將(jiang)P7 Adaptor與帶(dai)有(you)Barcode序列(lie)的(de)overlap引物連(lian)接，進行重疊(die)延伸PCR擴(kuo)增(zeng)(zeng)唯一(yi)Barcode和(he)目標位(wei)點，同時連(lian)接P5 Adaptor，最終(zhong)形(xing)成用(yong)于Illumina平臺的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)子測序文庫（圖(tu)1d）。在(zai)(zai)沒有(you)裂(lie)解(jie)細胞或Barcode的(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)中(zhong)(zhong)，完(wan)整的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)子不會形(xing)成，因此(ci)無法(fa)測序。在(zai)(zai)數據分析(xi)中(zhong)(zhong)，Barcode序列(lie)標記了(le)來自同一(yi)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)子，從(cong)而標記了(le)同一(yi)細胞。 為了證明DoTA-seq的廣泛應(ying)用，作者利用DoTA-seq進(jin)行多種不同類型微生(sheng)物種群的單(dan)細胞測序分析(xi)： 1、DoTA-seq可以可靠地對各種細菌混合物進行測序 圖2 通過16s rRNA測序(xu)分類的(de)(de)枯(ku)草芽孢桿菌和大腸桿菌中(zhong)檢測到給(gei)定基因的(de)(de)細胞比例(li) 利用(yong)16S rRNA基(ji)因的(de)(de)(de)序列對每個(ge)細(xi)胞的(de)(de)(de)種類進行(xing)分類。在(zai)約90%的(de)(de)(de)測序細(xi)胞中觀察到預期的(de)(de)(de)基(ji)因，表明(ming)DoTA-seq可以有(you)效地(di)捕獲(huo)單個(ge)細(xi)胞內的(de)(de)(de)靶基(ji)因（圖2）。發現在(zai)約0.2%的(de)(de)(de)細(xi)胞中檢測到假陽性，原因可能是質粒長(chang)度比基(ji)因組(zu)DNA小(xiao)(xiao)幾個(ge)數量(liang)級，在(zai)洗滌、裂解(jie)和儲存過程中，質粒有(you)更高的(de)(de)(de)機會(hui)從(cong)其同源(yuan)水凝(ning)膠中擴散到鄰近的(de)(de)(de)凝(ning)膠中。因此，小(xiao)(xiao)質粒上(shang)(shang)的(de)(de)(de)基(ji)因座(zuo)比染(ran)色體上(shang)(shang)的(de)(de)(de)基(ji)因座(zuo)有(you)更高的(de)(de)(de)假陽性率(lv)。 圖3 模擬(ni)菌群相對豐度 為(wei)了(le)研究DoTA-seq對(dui)混合菌落(luo)的(de)(de)準確性，作者按照(zhao)特定比(bi)(bi)例模擬了(le)一個(ge)微(wei)生物(wu)(wu)群(qun)落(luo)，并且加入(ru)了(le)一株(zhu)攜帶RFP基(ji)因(yin)(yin)質粒(li)的(de)(de)E.coil（~ 1%）和另一株(zhu)不攜帶該質粒(li)的(de)(de)E.coil（~ 99%），以(yi)評估(gu)DoTA-seq檢測單個(ge)物(wu)(wu)種遺(yi)傳(chuan)差異(yi)(yi)(yi)的(de)(de)能力(li)。結果發現在每個(ge)物(wu)(wu)種的(de)(de)約70-90%的(de)(de)細胞中(zhong)檢測到目標必需基(ji)因(yin)(yin)，造成這(zhe)(zhe)種差異(yi)(yi)(yi)的(de)(de)原因(yin)(yin)可(ke)能是某些(xie)基(ji)因(yin)(yin)比(bi)(bi)其(qi)他基(ji)因(yin)(yin)更有效地被捕獲(huo)。引物(wu)(wu)擴增(zeng)效率(lv)的(de)(de)差異(yi)(yi)(yi)可(ke)能導致這(zhe)(zhe)種差異(yi)(yi)(yi)。為(wei)了(le)減輕(qing)這(zhe)(zhe)種影響，可(ke)以(yi)增(zeng)加引物(wu)(wu)濃(nong)度或設計替代引物(wu)(wu)以(yi)提高效率(lv)。 綜上(shang)所述，DoTA-seq可以在(zai)多物種微生物群落(luo)的(de)單細(xi)胞水平上(shang)分析(xi)不同的(de)細(xi)菌。 2、DoTA-seq揭示(shi)了(le)復雜微生(sheng)物群(qun)落(luo)中的(de)基因動態 圖4 DoTA-seq能(neng)夠在(zai)復雜的(de)人類腸道微(wei)生(sheng)物(wu)群落中(zhong)跟蹤基因-物(wu)種動態 為了(le)證明(ming)(ming)可以通過DoTA-seq來跟蹤復雜微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)落中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素抗(kang)(kang)性基(ji)(ji)因（ARGs），作(zuo)者生(sheng)(sheng)成了(le)一(yi)個由25個不(bu)同(tong)且(qie)普遍存(cun)在(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)人類腸道微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)組(zu)成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)合成微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)落，并在(zai)(zai)公開基(ji)(ji)因組(zu)中(zhong)鑒定(ding)了(le)12個ARGs，設計了(le)DoTA-seq，結果(guo)發(fa)現(xian)了(le)該物(wu)種(zhong)(zhong)基(ji)(ji)因組(zu)序列(lie)中(zhong)未發(fa)現(xian)但(dan)利用(yong)DoTA-seq觀察到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)ARG（圖4a，綠框(kuang)標出），同(tong)時(shi)發(fa)現(xian)增加測序細胞的(de)(de)(de)(de)(de)(de)總數可以減少(shao)在(zai)(zai)DoTA-seq中(zhong)觀察到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)技術(shu)變(bian)異性（圖4b）。針(zhen)對前一(yi)個問(wen)題，作(zuo)者提出假設：在(zai)(zai)引物(wu)捕獲效率(lv)(lv)在(zai)(zai)不(bu)同(tong)處理中(zhong)恒(heng)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)前提下，基(ji)(ji)因流行率(lv)(lv)可能會(hui)隨著抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素壓力(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)而(er)變(bian)化(hua)。作(zuo)者設計了(le)實驗進行驗證（圖4c），結果(guo)表明(ming)(ming)大(da)多(duo)數物(wu)種(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)長在(zai)(zai)抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素的(de)(de)(de)(de)(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)下受到(dao)抑制（圖4d），在(zai)(zai)生(sheng)(sheng)長的(de)(de)(de)(de)(de)(de)物(wu)種(zhong)(zhong)中(zhong)，幾種(zhong)(zhong)ARG的(de)(de)(de)(de)(de)(de)流行率(lv)(lv)在(zai)(zai)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素濃(nong)度(du)下差(cha)異很大(da)，而(er)流行率(lv)(lv)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)反映了(le)含有該基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細胞比(bi)例的(de)(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)（圖4e）。 綜上所述(shu)，在單個菌落生長過(guo)程(cheng)中(zhong)，多個物種建立(li)了種群(qun)異質性，并(bing)且攜帶給定基因的種群(qun)部(bu)分可能會因抗生素脅(xie)迫(po)而發(fa)生變化。 3、DoTA-seq揭示(shi)了自然微生物群中的基因-分(fen)類群關系(xi) 圖5 DoTA-seq闡明了糞(fen)便微(wei)生物(wu)群落(luo)中(zhong)ARG和質粒分(fen)類(lei)群的關聯 為了評(ping)估DoTA-seq對天然微生物樣本(ben)的(de)(de)(de)(de)能力(li)，作者(zhe)使用(yong)DoTA-seq分(fen)(fen)(fen)析小(xiao)(xiao)鼠和人(ren)類(lei)(lei)腸道微生物組樣本(ben)。由于(yu)微流體液(ye)(ye)滴制(zhi)造的(de)(de)(de)(de)限制(zhi)，先從(cong)上清(qing)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞懸浮液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)分(fen)(fen)(fen)離出大碎片后進(jin)行(xing)DoTA-seq（圖5a），為了識別群落中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)DoTA-seq靶(ba)標，先進(jin)行(xing)宏(hong)基(ji)(ji)因組測序再(zai)從(cong)中(zhong)(zhong)搜索ARGs和質粒復制(zhi)子。在(zai)小(xiao)(xiao)鼠糞便(bian)樣本(ben)中(zhong)(zhong)，通過16S rRNA基(ji)(ji)因測序鑒(jian)定(ding)的(de)(de)(de)(de)豐(feng)(feng)富分(fen)(fen)(fen)類(lei)(lei)群在(zai)DoTA-seq結果中(zhong)(zhong)也很(hen)豐(feng)(feng)富（圖5b），DoTA-seq對具有特定(ding)分(fen)(fen)(fen)類(lei)(lei)特性的(de)(de)(de)(de)單(dan)細(xi)胞進(jin)行(xing)計數，而(er)基(ji)(ji)于(yu)傳統16S rRNA的(de)(de)(de)(de)相對豐(feng)(feng)度可能受到16S rRNA拷(kao)貝(bei)數的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)。DoTA-seq的(de)(de)(de)(de)主(zhu)要應用(yong)不是(shi)確定(ding)分(fen)(fen)(fen)類(lei)(lei)的(de)(de)(de)(de)相對豐(feng)(feng)度，而(er)是(shi)將(jiang)感興趣的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因與單(dan)細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)類(lei)(lei)身(shen)份(fen)聯系起(qi)來。作者(zhe)分(fen)(fen)(fen)別分(fen)(fen)(fen)析小(xiao)(xiao)鼠和人(ren)糞便(bian)樣本(ben)中(zhong)(zhong)ARG分(fen)(fen)(fen)類(lei)(lei)群和質粒分(fen)(fen)(fen)類(lei)(lei)群的(de)(de)(de)(de)關聯，揭示了ARG和質粒宿(su)主(zhu)范圍存在(zai)差異(yi)（圖5c，d）。 綜上所述，DoTA-seq可以在(zai)復雜的天然微生(sheng)物(wu)組中追蹤不同感興(xing)趣基因的分類關聯。 4、DoTA-seq能夠量化通過基因序列(lie)變(bian)異產生的細菌亞群(qun) 圖6 DoTA-seq揭示了脆弱(ruo)芽孢桿菌通(tong)過(guo)啟動(dong)子(zi)反(fan)轉產生的不同遺傳亞(ya)群(qun) 為了驗證DoTA-seq可以用(yong)于分析單細(xi)胞基因(yin)組中的(de)基因(yin)重排(pai)或突變，作者選擇脆弱(ruo)芽孢桿菌莢膜(mo)多(duo)糖合成(CPS)操縱子(zi)(zi)進行測試(shi)驗證，CPS操縱子(zi)(zi)的(de)啟(qi)動子(zi)(zi)受內源性重組酶(mei)（mpi）調(diao)控，mpi反轉每個操縱子(zi)(zi)的(de)啟(qi)動子(zi)(zi)序列，使啟(qi)動子(zi)(zi)在(zai)ON和OFF狀態(tai)之間切換。使用(yong)啟(qi)動子(zi)(zi)區(qu)域(yu)的(de)DoTA-seq擴增子(zi)(zi)序列來推斷每個細(xi)胞的(de)組合啟(qi)動子(zi)(zi)ON/OFF狀態(tai)（圖6a，b）。結果(guo)表明存在(zai)廣(guang)泛(fan)的(de)種(zhong)群異質性（圖6c，d），DoTA-seq可用(yong)于確定單細(xi)胞內靶基因(yin)的(de)存在(zai)/缺失和核苷酸序列，具(ju)有廣(guang)泛(fan)的(de)潛在(zai)應用(yong)前景。
結 論 綜(zong)上所述，DoTA-seq是一個可訪問和通(tong)用的(de)平臺，用于微(wei)生物的(de)超高(gao)通(tong)量單(dan)細胞(bao)遺傳分析(xi)(xi)，但DoTA-seq的(de)潛在應用范圍遠(yuan)不止于此，通(tong)過不同(tong)實驗目標調整工作流(liu)程，可以應用于除DNA測序以外單(dan)細胞(bao)測序，例(li)如(ru)(ru)通(tong)過DoTA-seq對預先標記有DNA Barcode偶聯抗體的(de)細胞(bao)進行(xing)單(dan)細胞(bao)表型分析(xi)(xi)，如(ru)(ru)蛋白質(zhi)表達(da)或(huo)細胞(bao)表面標記，同(tong)時理(li)論上，DoTA-seq中的(de)兩個液滴生成步驟都可以用無微(wei)流(liu)體的(de)液滴生成方法來(lai)代替。因此，作者預計該(gai)工作流(liu)的(de)未來(lai)版本(ben)(ben)根本(ben)(ben)不需要微(wei)流(liu)體，這(zhe)將大大提高(gao)DoTA-seq的(de)吞吐量和并(bing)行(xing)性。
