蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)學(xue)(xue)方(fang)法可以(yi)按照前處理(li)以(yi)及定(ding)量(liang)(liang)原理(li)不(bu)同，初步分為(wei)非標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)定(ding)量(liang)(liang)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)組(zu)學(xue)(xue)和標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)定(ding)量(liang)(liang)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)學(xue)(xue)。非標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)學(xue)(xue)顧名思(si)義即不(bu)對樣(yang)(yang)本(ben)中(zhong)提取(qu)的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)或者肽(tai)段(duan)進(jin)行同位素標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)簽標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)，直(zhi)接(jie)通過(guo)液相(xiang)質(zhi)譜對蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)酶解肽(tai)段(duan)進(jin)行檢(jian)測，通過(guo)比較不(bu)同樣(yang)(yang)品間肽(tai)段(duan)的(de)譜圖強度(du)，從而獲得樣(yang)(yang)本(ben)中(zhong)相(xiang)對定(ding)量(liang)(liang)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)表達水(shui)平。相(xiang)比TMT/iTRAQ標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)學(xue)(xue)來說，不(bu)存(cun)在因為(wei)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)試劑數量(liang)(liang)有限的(de)樣(yang)(yang)本(ben)檢(jian)測通量(liang)(liang)問(wen)題(ti)(ti)以(yi)及樣(yang)(yang)本(ben)標(biao)(biao)(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)產生(sheng)批次(ci)效應問(wen)題(ti)(ti)。

圖1 非標(biao)記(ji)蛋(dan)白(bai)質(zhi)組學分類(lei)

非標(biao)記蛋白(bai)質組學(xue)根據數據采集模式和搜庫方式，分為DDA-Label free、DDA Library +DIA以及Library free DIA（Direct DIA）三類。我們將從技術原理流程(cheng)、蛋白(bai)檢(jian)測數量、價(jia)格等(deng)方面全面解析這三類技術，幫助大家對這三種技術有更清楚的了解。

當(dang)樣(yang)本中提取(qu)的蛋白酶解成肽(tai)段后(hou)，肽(tai)段經液相(xiang)色譜(pu)分級分離后(hou)被電離帶(dai)上電荷進入質(zhi)量分析器中記錄譜(pu)圖信(xin)號。

（1）數據(ju)依(yi)賴(lai)型采集原(yuan)理（Data-dependent Acquisition-DDA）：首先(xian)帶電荷的(de)肽段（母(mu)離(li)子(zi)(zi)）會(hui)(hui)經過全掃(sao)(sao)描得到(dao)(dao)一(yi)級(ji)(ji)(ji)譜(pu)圖(tu)，隨(sui)后質譜(pu)會(hui)(hui)根據(ju)參(can)數的(de)設定(ding)(ding)對一(yi)級(ji)(ji)(ji)質譜(pu)圖(tu)中的(de)肽段母(mu)離(li)子(zi)(zi)按照信(xin)號強度(du)由高到(dao)(dao)低(di)進行(xing)(xing)選(xuan)(xuan)擇(ze)（TOP20），送(song)到(dao)(dao)碰撞室(shi)進行(xing)(xing)碎(sui)裂(lie)(lie)，然后掃(sao)(sao)描碎(sui)片(pian)離(li)子(zi)(zi)得到(dao)(dao)對應(ying)肽段母(mu)離(li)子(zi)(zi)的(de)二(er)級(ji)(ji)(ji)質譜(pu)圖(tu)，通過搜庫軟件(jian)對原(yuan)始文件(jian)進行(xing)(xing)分析(xi)，一(yi)方面對一(yi)級(ji)(ji)(ji)質譜(pu)圖(tu)峰面積(ji)進行(xing)(xing)積(ji)分得定(ding)(ding)量信(xin)息，另一(yi)方面對二(er)級(ji)(ji)(ji)質譜(pu)碎(sui)片(pian)進行(xing)(xing)解(jie)析(xi)得到(dao)(dao)蛋白質定(ding)(ding)性信(xin)息。DDA依(yi)賴(lai)于每次(ci)掃(sao)(sao)描的(de)母(mu)離(li)子(zi)(zi)豐度(du)排序進行(xing)(xing)二(er)級(ji)(ji)(ji)質譜(pu)分析(xi)，這(zhe)種模(mo)式下，一(yi)些有價值的(de)但豐度(du)較低(di)的(de)母(mu)離(li)子(zi)(zi)可(ke)能不會(hui)(hui)被(bei)選(xuan)(xuan)擇(ze)進行(xing)(xing)碎(sui)裂(lie)(lie)檢測，導(dao)致無法實現定(ding)(ding)性。

圖2 DDA-Labelfree非標記蛋白質組學流程圖

（2）數據(ju)非依賴采(cai)(cai)集（DIA）原(yuan)理：樣品在進入二(er)級(ji)質(zhi)譜時，按(an)照設定的(de)質(zhi)荷比(bi)m/z范圍分(fen)為若(ruo)干個窗(chuang)(chuang)口(kou)(kou)，每個窗(chuang)(chuang)口(kou)(kou)內的(de)一(yi)級(ji)母(mu)離子(zi)被分(fen)割在一(yi)起，二(er)級(ji)質(zhi)譜采(cai)(cai)集的(de)是(shi)每個窗(chuang)(chuang)口(kou)(kou)中所有肽段母(mu)離子(zi)一(yi)起打碎后的(de)碎片離子(zi)，換句話說DIA不依賴于一(yi)級(ji)母(mu)離子(zi)的(de)豐度(du)排序(xu)碎裂，而(er)是(shi)將全(quan)部一(yi)級(ji)母(mu)離子(zi)進行(xing)二(er)級(ji)碎裂，分(fen)窗(chuang)(chuang)口(kou)(kou)采(cai)(cai)集的(de)模式使得到的(de)二(er)級(ji)碎片信(xin)息(xi)更豐富。因此，DIA數據(ju)更完整，檢測(ce)深度(du)高且重復性好，通過多個二(er)級(ji)質(zhi)譜峰面(mian)積(ji)進行(xing)定量，準(zhun)確度(du)高。

相較于DDA模式有損(sun)、隨機，DIA具有全景式掃描(miao)、數據無遺漏、定量準確性(xing)高(gao)重復性(xing)好

圖3 DDA和DIA采集模式直觀比(bi)較（來(lai)源community.sciex.com）

DIA蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組學由于采集譜圖(tu)復雜的(de)問題(ti)，導致分(fen)(fen)析(xi)困(kun)難(nan)。常規方(fang)(fang)法解(jie)決方(fang)(fang)法主要是：DDA Library +DIA，需要將樣(yang)(yang)本先形成(cheng)Pool樣(yang)(yang)本，進(jin)而DDA分(fen)(fen)級上機(ji)建立譜圖(tu)庫(ku)，基于譜圖(tu)庫(ku)去匹配(pei)正式上機(ji)檢測樣(yang)(yang)本中肽段(duan)信息，建庫(ku)的(de)意義在于提供(gong)了一個全(quan)面(mian)、無偏見的(de)參考數(shu)據庫(ku)，這(zhe)有助于在后續的(de)實驗(yan)中更準(zhun)確地鑒定(ding)和量化(hua)生(sheng)物(wu)樣(yang)(yang)本中的(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)，這(zhe)也導致DIA分(fen)(fen)析(xi)需要額外的(de)建庫(ku)成(cheng)本，同(tong)時(shi)也比較耗時(shi)。另一種解(jie)決DIA譜圖(tu)解(jie)析(xi)困(kun)難(nan)的(de)方(fang)(fang)法則是Library free DIA（Direct DIA）。

圖4 常規建庫DIA蛋白(bai)質(zhi)組學流(liu)程(cheng)

（3）Library free DIA（Direct DIA）原理：該原理和(he)(he)傳(chuan)統(tong)DIA數據(ju)(ju)(ju)掃描原理一樣，傳(chuan)統(tong)DIA依賴于DDA建(jian)庫(ku)(ku)(ku)(ku)數據(ju)(ju)(ju)，當建(jian)庫(ku)(ku)(ku)(ku)數據(ju)(ju)(ju)中未采(cai)集到有效二(er)級譜圖(tu)(tu)時則影響(xiang)實(shi)驗結果。為了解(jie)決DIA譜圖(tu)(tu)復雜且解(jie)析(xi)困難的(de)問(wen)題(ti)，不(bu)依賴數據(ju)(ju)(ju)庫(ku)(ku)(ku)(ku)的(de)Library free DIA（Direct DIA）蛋(dan)白(bai)(bai)質組學(xue)方法(fa)應(ying)運(yun)而生，與傳(chuan)統(tong)DIA分析(xi)策(ce)略相比不(bu)進(jin)行DDA分級建(jian)庫(ku)(ku)(ku)(ku)，而是(shi)直接利用(yong)深度(du)機(ji)器學(xue)習算法(fa)實(shi)現，通(tong)過(guo)搜索特(te)定物(wu)種數據(ju)(ju)(ju)庫(ku)(ku)(ku)(ku)蛋(dan)白(bai)(bai)序列生成(cheng)(cheng)預測譜圖(tu)(tu)庫(ku)(ku)(ku)(ku)并(bing)和(he)(he)DIA上機(ji)實(shi)際樣本原始文(wen)件譜圖(tu)(tu)進(jin)行匹配(pei)打分，同時去除假陽結果。無(wu)需構(gou)建(jian)圖(tu)(tu)譜庫(ku)(ku)(ku)(ku)的(de)Library free DIA（Direct DIA）策(ce)略，省去了建(jian)庫(ku)(ku)(ku)(ku)成(cheng)(cheng)本和(he)(he)時間成(cheng)(cheng)本，同時保留了DIA可重(zhong)復的(de)定量的(de)優勢，可以說(shuo)是(shi)蛋(dan)白(bai)(bai)質組學(xue)的(de)潛力股(gu)。

圖(tu)5 非建庫(ku)DIA蛋白質組學流程(cheng)

那么，非標記蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)組(zu)學(xue)(xue)這(zhe)三(san)種方(fang)法檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)結果如何？縱觀已發表的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)組(zu)學(xue)(xue)文獻。首先我們發現數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)非依(yi)賴(lai)型采集方(fang)法（DIA）檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)數(shu)(shu)量普遍高于數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)依(yi)賴(lai)型采集（DDA）。根(gen)據(ju)(ju)(ju)上期我們Astral蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)組(zu)學(xue)(xue)的(de)(de)(de)(de)測(ce)(ce)(ce)試數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)顯(xian)示Library free DIA（Direct DIA）檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)數(shu)(shu)據(ju)(ju)(ju)比（DDA--Label free）高出(chu)(chu)10%左(zuo)右(you)，文獻中也呈現類似(si)規律[1-3]。其次關于建(jian)庫的(de)(de)(de)(de)DIA和(he)非建(jian)庫的(de)(de)(de)(de)Library free DIA（Direct DIA）二(er)者(zhe)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)數(shu)(shu)量的(de)(de)(de)(de)比較(jiao)，這(zhe)二(er)者(zhe)從(cong)技(ji)(ji)術本身來考(kao)慮(lv)沒有(you)絕對的(de)(de)(de)(de)優劣，現階段(duan)隨著儀器的(de)(de)(de)(de)更新和(he)質(zhi)(zhi)譜方(fang)法的(de)(de)(de)(de)開發以及機器學(xue)(xue)習(xi)的(de)(de)(de)(de)使用和(he)優化，Library-free DIA和(he) DDA Library DIA的(de)(de)(de)(de)鑒(jian)定數(shu)(shu)量相差不大(da)，近(jin)期的(de)(de)(de)(de)一(yi)些研究表明(ming)，Library free DIA（Direct DIA）檢(jian)(jian)出(chu)(chu)數(shu)(shu)量高于建(jian)庫Library DIA的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)方(fang)法檢(jian)(jian)出(chu)(chu)的(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)量[4-5]，也從(cong)側(ce)面(mian)說明(ming)Library free DIA（Direct DIA）技(ji)(ji)術的(de)(de)(de)(de)應(ying)用將成為大(da)勢所趨。

圖6 文(wen)獻(xian)非標記方法比較

目(mu)前(qian)Direct-DIA由于(yu)其定(ding)量(liang)準確度高(gao)、無偏采(cai)集模式、價格較低(di)、數據結果好等(deng)方(fang)面的(de)優勢，在蛋白質組學中(zhong)大受歡(huan)迎(ying)，可(ke)謂“后起之秀”。具體(ti)技術的(de)選(xuan)擇建議根據應用目(mu)的(de)，經費(fei)和結果等(deng)多方(fang)面考(kao)慮選(xuan)擇更合適的(de)技術。

案(an)例一

酒精相(xiang)關肝病的非侵入性蛋白標志物[6]

2022年，馬克(ke)斯·普朗克(ke)生(sheng)物(wu)化(hua)學(xue)研(yan)(yan)究(jiu)所的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)團隊利用(yong)基(ji)于質(zhi)譜的(de)(de)(de)Library-DIA蛋白組(zu)學(xue)和機器學(xue)習模(mo)型進行(xing)(xing)人群(qun)大(da)隊列研(yan)(yan)究(jiu)，確(que)定(ding)了早期酒精相關(guan)肝(gan)(gan)(gan)病(bing)（ALD）中的(de)(de)(de)纖(xian)維化(hua)、炎癥和脂(zhi)肪變性三種疾病(bing)非入(ru)侵性蛋白質(zhi)組(zu)合生(sheng)物(wu)標(biao)(biao)志物(wu)，發表了題為(wei)“Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease”的(de)(de)(de)文章，通過(guo)收集(ji)ALD患者(459例(li)(li)），健康(kang)對照(zhao)（137例(li)(li)）和ALD獨立驗證隊列（63例(li)(li)）人的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)(gan)臟和血液進行(xing)(xing)DIA蛋白組(zu)學(xue)研(yan)(yan)究(jiu)，發現肝(gan)(gan)(gan)臟生(sheng)理病(bing)例(li)(li)相關(guan)的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)(gan)臟和血漿均發生(sheng)顯(xian)著的(de)(de)(de)蛋白質(zhi)組(zu)重(zhong)塑現象(xiang)，闡述了蛋白質(zhi)組(zu)合生(sheng)物(wu)標(biao)(biao)志物(wu)在肝(gan)(gan)(gan)病(bing)臨(lin)床診斷和預后評估中擁有巨(ju)大(da)的(de)(de)(de)潛力(li)。不但(dan)反映出(chu)肝(gan)(gan)(gan)臟在疾病(bing)狀態(tai)下的(de)(de)(de)特定(ding)蛋白質(zhi)表達模(mo)式，提(ti)供更(geng)為(wei)準確(que)、敏(min)感的(de)(de)(de)診斷工(gong)具。此(ci)外，通過(guo)監(jian)測這些生(sheng)物(wu)標(biao)(biao)志物(wu)的(de)(de)(de)變化(hua)，可以預測疾病(bing)的(de)(de)(de)進展和治療效(xiao)果，為(wei)肝(gan)(gan)(gan)病(bing)的(de)(de)(de)個性化(hua)治療提(ti)供有力(li)支(zhi)持。

案例二

多組(zu)學方(fang)法揭示兩種冠狀病(bing)毒(du)的分(fen)子機制[7]

2021年，慕尼黑工業大學(xue)科(ke)研工作(zuo)者發表了(le)題為(wei)“Multilevel proteomics reveals host perturbations by SARS-CoV-2 and SARS-CoV”的(de)(de)(de)研究(jiu)性(xing)論文。該研究(jiu)同時針(zhen)對SARS-CoV-2和SARS-CoV兩種冠(guan)(guan)狀病(bing)(bing)(bing)毒進行研究(jiu)，探索了(le)SARS-CoV-2和SARS-CoV兩種病(bing)(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)相互作(zuo)用。同時，檢測(ce)了(le)1200多個(ge)肺(fei)源(yuan)性(xing)人類(lei)細胞(bao)系(xi)受到病(bing)(bing)(bing)毒感染的(de)(de)(de)轉錄組、Direct DIA蛋(dan)白質組、泛素組和磷(lin)酸(suan)化蛋(dan)白組的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。通過(guo)研究(jiu)病(bing)(bing)(bing)毒蛋(dan)白質與宿主蛋(dan)白質之間的(de)(de)(de)相互作(zuo)用以及(ji)修(xiu)飾位點以及(ji)通路變化，成功發現了(le)SARS-CoV-2的(de)(de)(de)致病(bing)(bing)(bing)特性(xing)，并深入探討(tao)了(le)冠(guan)(guan)狀病(bing)(bing)(bing)毒家族的(de)(de)(de)潛在藥物(wu)靶點，得以精確地(di)引導候(hou)選(xuan)藥物(wu)的(de)(de)(de)開(kai)發，為(wei)抗擊SARS-CoV-2和其他冠(guan)(guan)狀病(bing)(bing)(bing)毒疫情提供了(le)更為(wei)有(you)效的(de)(de)(de)治療方(fang)案。這不僅(jin)對于抑制(zhi)SARS-CoV-2的(de)(de)(de)傳播具有(you)至關重要的(de)(de)(de)意義(yi)，也為(wei)未來冠(guan)(guan)狀病(bing)(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)防治工作(zuo)奠定了(le)堅實的(de)(de)(de)基礎。

案(an)例三

數據(ju)(ju)非依(yi)賴(lai)型采(cai)集模式（DIA）中數據(ju)(ju)分析工具的比較分析[5]

Molecular & Cellular Proteomics（IF7.0）-A Comparative Analysis of Data Analysis Tools for Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry

2023年西湖(hu)大學研究團隊發表了題(ti)為(wei)“A Comparative Analysis of Data Analysis Tools for Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry”的(de)文章，從三種不(bu)同(tong)類型的(de)質(zhi)量分析(xi)儀（TripleTOF, Orbitrap, and TimsTOF Pro）中獲得的(de)六個DIA數據集，并評(ping)估了5種DIA分析(xi)軟(ruan)件工具(ju)(OpenSwath、Encyclopedia、Skyline、DIA-NN和(he)(he)Spectronaut）的(de)性(xing)能。發現(xian)DIA-NN的(de)性(xing)能顯著優(you)于其他(ta)工具(ju)，研究人員接下來(lai)評(ping)估了在特定工具(ju)中唯一識(shi)別的(de)多肽和(he)(he)蛋(dan)白質(zhi)。比較發現(xian)當譜庫(ku)的(de)可(ke)比性(xing)有限時，無譜庫(ku)方(fang)法優(you)于基于譜庫(ku)的(de)方(fang)法。此研究為(wei) DIA 數據分析(xi)工具(ju)提(ti)供了全面指導。