胞(bao)外小囊泡(pao)(sEV)是(shi)由細(xi)胞(bao)分(fen)泌的(de)(de)(de)微(wei)小囊泡(pao)，攜帶(dai)蛋白質、脂質和(he)RNA等多種內容物，廣泛存在(zai)于組織(zhi)微(wei)環境中(zhong)(zhong)，充當(dang)細(xi)胞(bao)間(jian)信(xin)(xin)息交流的(de)(de)(de)“信(xin)(xin)使”角色，在(zai)免疫反應、病毒致(zhi)病性(xing)和(he)癌癥進展中(zhong)(zhong)發揮重要作用。許多研究表(biao)(biao)明，受到(dao)來源細(xi)胞(bao)復(fu)雜和(he)組織(zhi)生理狀態(tai)變(bian)化等因素影(ying)響(xiang)，細(xi)胞(bao)釋放的(de)(de)(de)sEV數(shu)量和(he)組成會有(you)很大的(de)(de)(de)差異。傳(chuan)統的(de)(de)(de)基于批量RNA測序(xu)的(de)(de)(de)方法(fa)(fa)往往將這些復(fu)雜的(de)(de)(de)信(xin)(xin)號結合(he)在(zai)一(yi)起，因此(ci)無法(fa)(fa)代(dai)表(biao)(biao)sEV群體的(de)(de)(de)真正復(fu)雜性(xing)。目(mu)前嘗試進行sEV異質性(xing)分(fen)析方法(fa)(fa)的(de)(de)(de)主要局限性(xing)在(zai)于需(xu)要分(fen)離和(he)純化sEV，會導(dao)致(zhi)丟失有(you)關原(yuan)始(shi)組織(zhi)微(wei)環境的(de)(de)(de)信(xin)(xin)息。因此(ci)，迫切(qie)需(xu)要開(kai)發一(yi)種能(neng)夠同時捕獲細(xi)胞(bao)和(he)sEV異質性(xing)的(de)(de)(de)方法(fa)(fa)，在(zai)基于液滴的(de)(de)(de)scRNA-seq數(shu)據集中(zhong)(zhong)分(fen)辨(bian)sEV，彌合(he)sEV生物學(xue)和(he)單細(xi)胞(bao)轉錄組學(xue)之間(jian)的(de)(de)(de)差距。

在國(guo)家自然科學(xue)基金項目資助下，中國(guo)科學(xue)院(yuan)北京生命科學(xue)研究院(yuan)趙方慶(qing)團隊(dui)建立了胞(bao)外小囊泡異質(zhi)性(xing)追蹤算法SEVtras(sEV-containing droplet identification in scRNA-seq data)，用(yong)于(yu)在液滴分辨率下描繪(hui)sEV信(xin)號并評估不同細胞(bao)類型的sEV分泌(mi)活性(xing)。

研究人(ren)員為(wei)了探究該方法的(de)(de)可行(xing)性(xing)，首先(xian)使用(yong)NTA分(fen)(fen)析(xi)觀察到3種(zhong)(zhong)小(xiao)鼠組(zu)織(zhi)經過標準(zhun)scRNA-seq預處理(li)步驟(zou)后上清液中存在(zai)(zai)大(da)量(liang)(liang)(liang)sEV。使用(yong)NanoLuc標記的(de)(de)sEV(其在(zai)(zai)引入(ru)特定物質時發光(guang))摻入(ru)樣(yang)品中，并進(jin)行(xing)標準(zhun)scRNA-seq預處理(li)步驟(zou)，觀察到大(da)量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)sEV保留。然后分(fen)(fen)離了胞(bao)外(wai)(wai)小(xiao)囊(nang)(nang)(nang)泡、大(da)囊(nang)(nang)(nang)泡和細胞(bao)碎片，進(jin)行(xing)了單獨的(de)(de)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)。結果顯(xian)示，胞(bao)外(wai)(wai)小(xiao)囊(nang)(nang)(nang)泡的(de)(de)轉錄(lu)譜(pu)與其他幾類存在(zai)(zai)顯(xian)著差(cha)異，并且能夠通過胞(bao)外(wai)(wai)小(xiao)囊(nang)(nang)(nang)泡基(ji)因集的(de)(de)富集來識別(bie)。基(ji)于(yu)這些發現(xian)，研究人(ren)員設計了一種(zhong)(zhong)利用(yong)期望(wang)最(zui)大(da)化算法的(de)(de)胞(bao)外(wai)(wai)小(xiao)囊(nang)(nang)(nang)泡算法，并提(ti)出(chu)衡量(liang)(liang)(liang)胞(bao)外(wai)(wai)小(xiao)囊(nang)(nang)(nang)泡分(fen)(fen)泌(mi)活性(xing)的(de)(de)度(du)量(liang)(liang)(liang)指(zhi)標。

圖(tu)1 SEVtras的(de)可行性(xing)評估與分析流(liu)程(cheng)

為(wei)了評(ping)估(gu)(gu)算法的(de)(de)性(xing)(xing)能(neng)，設計了三種類型(xing)(xing)的(de)(de)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)測序(xu)實(shi)(shi)驗：(1)模(mo)擬數(shu)據評(ping)估(gu)(gu)：基(ji)于肥大(da)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)及其sEV通過(guo)模(mo)擬含(han)有(you)(you)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)碎片(pian)(pian)或(huo)sEV的(de)(de)無(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)液滴(di)生成數(shu)據集(ji)，SEVtras表(biao)(biao)現(xian)出(chu)穩健的(de)(de)性(xing)(xing)能(neng)(AUC > 0.85)，表(biao)(biao)明(ming)它(ta)可以(yi)耐受(shou)每個液滴(di)的(de)(de)sEV分(fen)(fen)(fen)數(shu)和(he)UMI計數(shu)的(de)(de)影響。(2)與(yu)真實(shi)(shi)sEV scRNA-seq數(shu)據的(de)(de)相似性(xing)(xing)評(ping)估(gu)(gu)：用MSC和(he)293F細(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)來源sEV進行(xing)(xing)(xing)了scRNA-seq。發現(xian)與(yu)SEVtras鑒(jian)定出(chu)的(de)(de)含(han)有(you)(you)碎片(pian)(pian)的(de)(de)液滴(di)相比(bi)，鑒(jian)定含(han)有(you)(you)sEV的(de)(de)液滴(di)與(yu)實(shi)(shi)況數(shu)據集(ji)之間的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)相關(guan)性(xing)(xing)更高。UMAP分(fen)(fen)(fen)析表(biao)(biao)明(ming)，含(han)有(you)(you)sEV的(de)(de)液滴(di)分(fen)(fen)(fen)布與(yu)實(shi)(shi)驗分(fen)(fen)(fen)離的(de)(de)sEV的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)布緊密重疊，而碎片(pian)(pian)的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)布則不同。證明(ming)了SEVtras可以(yi)可靠地檢測scRNA-seq數(shu)據集(ji)中(zhong)的(de)(de)sEV信號。(3)評(ping)估(gu)(gu)SEVtras在(zai)復雜(za)背景下的(de)(de)穩健性(xing)(xing)：進行(xing)(xing)(xing)了涉及細(xi)(xi)胞(bao)(bao)碎片(pian)(pian)和(he)大(da)EV(IEV)的(de)(de)加(jia)標實(shi)(shi)驗，將兩種類型(xing)(xing)的(de)(de)刺突分(fen)(fen)(fen)別加(jia)入MSC單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液中(zhong)進行(xing)(xing)(xing)scRNA-seq和(he)SEVtras鑒(jian)定。細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)轉錄表(biao)(biao)達(da)譜高度重疊，表(biao)(biao)明(ming)刺突不影響細(xi)(xi)胞(bao)(bao)狀(zhuang)態。引(yin)入一種新的(de)(de)指標sEV分(fen)(fen)(fen)泌活性(xing)(xing)指數(shu)(ESAI)，來量化(hua)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)sEV分(fen)(fen)(fen)泌活動，即給(gei)定樣品中(zhong)含(han)有(you)(you)sEV的(de)(de)液滴(di)數(shu)量與(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)數(shu)量的(de)(de)比(bi)值。

除(chu)此之外，在培養的MSC細胞中(zhong)(zhong)加入莫(mo)能菌素鈉(na)鹽(MON)來刺激(ji)MSC的分泌活性(xing)以及加入3X分離(li)的sEV以進一步評估鑒定(ding)特異(yi)性(xing)。基于以上(shang)驗證，證明SEVtras可以特異(yi)性(xing)識(shi)別(bie)scRNA-seq樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)的sEV信(xin)號(hao)。

圖2 SEVtras的性(xing)能驗證

為了將SEVtras初步(bu)應用(yong)于(yu)(yu)研究不(bu)(bu)(bu)同(tong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sEV異質性(xing)，對MSC和(he)(he)293F細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)scRNA-seq數(shu)據進行UMAP分(fen)(fen)(fen)析，以(yi)比較MSC和(he)(he)293F細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)sEV的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)表達譜，來源(yuan)于(yu)(yu)2種(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sEV之(zhi)間明顯(xian)分(fen)(fen)(fen)離，但(dan)與(yu)其各自的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)原始細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)重疊(die)。表明來源(yuan)于(yu)(yu)不(bu)(bu)(bu)同(tong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sEV具(ju)有(you)不(bu)(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特征，從而為在(zai)復雜的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組織(zhi)微環境中準確(que)地反卷積不(bu)(bu)(bu)同(tong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型sEV分(fen)(fen)(fen)泌(mi)活(huo)(huo)性(xing)奠定(ding)了基(ji)礎(chu)。為了進一(yi)(yi)步(bu)驗證SEVtras鑒定(ding)不(bu)(bu)(bu)同(tong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sEV分(fen)(fen)(fen)泌(mi)活(huo)(huo)性(xing)，將該(gai)算法應用(yong)于(yu)(yu)15種(zhong)正常人體組織(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)scRNA-seq數(shu)據集(ji)，以(yi)證明SEVtras應用(yong)于(yu)(yu)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉錄(lu)組學分(fen)(fen)(fen)析的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)潛力(li)。在(zai)條形(xing)碼驗證和(he)(he)UMI過濾后(hou)，共獲(huo)得657407個液(ye)滴(di)，分(fen)(fen)(fen)析每(mei)種(zhong)組織(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ESAI，發現組織(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sEV分(fen)(fen)(fen)泌(mi)能力(li)各不(bu)(bu)(bu)相同(tong)(ESAI= 1.1±2%)。基(ji)于(yu)(yu)ESAI，血(xue)液(ye)樣(yang)品排(pai)名第一(yi)(yi)，與(yu)以(yi)前的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究一(yi)(yi)致，皮(pi)膚也(ye)顯(xian)示(shi)出比其他(ta)組織(zhi)更(geng)高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ESAI，這與(yu)真皮(pi)內的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)白色脂肪細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)具(ju)有(you)高sEV分(fen)(fen)(fen)泌(mi)能力(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)觀(guan)察結果一(yi)(yi)致。這些結果表明ESAI可(ke)(ke)以(yi)有(you)效地代表不(bu)(bu)(bu)同(tong)組織(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)sEV分(fen)(fen)(fen)泌(mi)活(huo)(huo)性(xing)，并且(qie)SEVtras可(ke)(ke)以(yi)捕獲(huo)sEV分(fen)(fen)(fen)泌(mi)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組織(zhi)異質性(xing)。

圖3 MSC和293F細胞的(de)sEV分泌(mi)活性

圖4 SEVtras深化的15種人體組織的單細胞轉錄(lu)組分(fen)析(xi)

為了(le)(le)進(jin)一(yi)步探索SEVtras在(zai)(zai)復雜疾病(bing)背景下的(de)(de)廣(guang)泛適用性(xing)(xing)，收集了(le)(le)4種不同癌(ai)癥的(de)(de)scRNA-seq數(shu)(shu)據(ju)集，包括胰腺導管(guan)腺癌(ai)、胃癌(ai)、前列腺癌(ai)和大腸癌(ai)，總計77個樣(yang)本(ben)，超過220000個細(xi)胞。線(xian)性(xing)(xing)回歸模型消除批次效應(ying)，計算這些樣(yang)品的(de)(de)ESAI，并觀察到(dao)平均ESAI為10.6±12.3%，證實(shi)了(le)(le)與正常組(zu)織(zhi)相比，腫(zhong)瘤sEV分(fen)(fen)泌(mi)活性(xing)(xing)升(sheng)高(gao)。但不知這種變異性(xing)(xing)的(de)(de)影響的(de)(de)因素是樣(yang)品是否來源于(yu)腫(zhong)瘤。然后將臨床信息與scRNA-seq數(shu)(shu)據(ju)集相匹配以探索sEV分(fen)(fen)泌(mi)活性(xing)(xing)在(zai)(zai)腫(zhong)瘤進(jin)展中(zhong)的(de)(de)作用。在(zai)(zai)PDAC數(shu)(shu)據(ju)集中(zhong)，血管(guan)侵襲(xi)(xi)與ESAI高(gao)度正相關。表(biao)明(ming)(ming)ESAI可(ke)能指示早期(qi)的(de)(de)腫(zhong)瘤進(jin)展。同時追蹤了(le)(le)sEV的(de)(de)來源細(xi)胞類型以確定血管(guan)侵襲(xi)(xi)組(zu)中(zhong)sEV分(fen)(fen)泌(mi)活性(xing)(xing)升(sheng)高(gao)的(de)(de)誘(you)因，分(fen)(fen)析表(biao)明(ming)(ming)血管(guan)侵襲(xi)(xi)組(zu)淋巴細(xi)胞的(de)(de)ESAI明(ming)(ming)顯高(gao)于(yu)無(wu)血管(guan)侵襲(xi)(xi)組(zu)，而淋巴細(xi)胞數(shu)(shu)量在(zai)(zai)2組(zu)中(zhong)沒有觀察到(dao)顯著差異。表(biao)明(ming)(ming)ESAI在(zai)(zai)區分(fen)(fen)腫(zhong)瘤血管(guan)侵襲(xi)(xi)方面具有潛力(li)。

圖(tu)5 ESAI與早期腫(zhong)瘤的(de)血管侵襲密切(qie)相關

綜上所述(shu)，SEVtras能(neng)(neng)夠(gou)在分析(xi)sEV時達到極高分辨率-單(dan)液(ye)滴水平，從而更全面地(di)探索源自(zi)不(bu)同組織的(de)(de)(de)sEV的(de)(de)(de)固有異(yi)(yi)質性，同時它能(neng)(neng)夠(gou)建(jian)立sEV與(yu)其來源細(xi)胞(bao)(bao)類型(xing)之間的(de)(de)(de)聯系，能(neng)(neng)夠(gou)從胞(bao)(bao)外的(de)(de)(de)視角(jiao)挖掘出數(shu)據中隱藏的(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)學信息，有助于更深(shen)入地(di)理(li)解組織生(sheng)理(li)病理(li)活(huo)動背后的(de)(de)(de)機制(zhi)。SEVtras能(neng)(neng)夠(gou)特異(yi)(yi)的(de)(de)(de)識(shi)別(bie)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)測(ce)序數(shu)據中的(de)(de)(de)胞(bao)(bao)外小囊(nang)泡，并且(qie)揭示了不(bu)同類型(xing)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)胞(bao)(bao)外小囊(nang)泡分泌活(huo)性，為(wei)目(mu)前單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)轉錄組分析(xi)提供了獨特的(de)(de)(de)“胞(bao)(bao)外視角(jiao)”。