2024-06-06
引言 機(ji)(ji)制研(yan)究(jiu)難？機(ji)(ji)制研(yan)究(jiu)無(wu)從下手？機(ji)(ji)制研(yan)究(jiu)后續(xu)如何(he)開(kai)展？本篇文(wen)章(zhang)將帶大家走入(ru)微生(sheng)物(wu)的世界，一起(qi)來看(kan)看(kan)蛋白質組學如何(he)發光發熱拯(zheng)救微生(sheng)物(wu)機(ji)(ji)制研(yan)究(jiu)吧！
前情提要 微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)存(cun)在(zai)(zai)于(yu)世界每個角落，具有分(fen)布廣、種類多(duo)(duo)的(de)(de)特(te)性。對于(yu)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)研(yan)(yan)(yan)究目前大多(duo)(duo)通過(guo)宏基因組和(he)代謝組學(xue)聯合去(qu)解(jie)析(xi)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)群落分(fen)布、功能情況。蛋(dan)白質組學(xue)的(de)(de)發展為微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)機制研(yan)(yan)(yan)究提供了(le)另外的(de)(de)參考角度。針對特(te)定(ding)(ding)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)進行蛋(dan)白質組學(xue)機制研(yan)(yan)(yan)究在(zai)(zai)深化生(sheng)(sheng)命(ming)科(ke)學(xue)研(yan)(yan)(yan)究、促進醫療健(jian)康、推動(dong)藥物(wu)研(yan)(yan)(yan)發、保(bao)護環境和(he)提升(sheng)農業科(ke)技等多(duo)(duo)個領(ling)域都具有重要意義(yi)。通過(guo)蛋(dan)白質組學(xue)聯合其他分(fen)子生(sheng)(sheng)物(wu)學(xue)實驗手(shou)段，我們(men)可以更深入(ru)地了(le)解(jie)某(mou)些特(te)定(ding)(ding)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)生(sheng)(sheng)理(li)功能和(he)代謝途徑，為相關領(ling)域的(de)(de)研(yan)(yan)(yan)究和(he)實際生(sheng)(sheng)產應用提供有力(li)支持。 圖(tu)1微生物蛋白質組學研究(jiu)整(zheng)體思(si)路圖(tu) 微生物蛋白質組學機制研究思路整體可以清晰地分為以下幾個步驟： 1、確定研究目標與對象：明確需要要解決的生物學問題，例如微生物的致病機制、適應機制、毒力因子等。 2、選擇合適的樣本類(lei)型和技術(shu)手段：表(biao)征(zheng)不(bu)同變量條件下表(biao)型和生理指(zhi)標(biao)的變化，并以單一蛋(dan)(dan)白(bai)質學(xue)或(huo)者多組學(xue)實驗為出發點對樣本中(zhong)的基因或(huo)者蛋(dan)(dan)白(bai)質進行定性定量檢測。 3、根據研究(jiu)目(mu)的對蛋白質(zhi)組(zu)學(xue)結果進生信(xin)分析和篩(shai)選，選定相關(guan)的特征分子，并進行PRM靶向(xiang)(xiang)靶向(xiang)(xiang)定量蛋白質(zhi)組(zu)學(xue)驗證。 4、利用(yong)酵母雙(shuang)雜交或免(mian)疫共沉淀對特(te)征(zheng)分(fen)子(zi)進行互作蛋白確認，并結合蛋白質組學探究其影響的上下游蛋白和(he)通路(lu)。構建敲除(chu)或過表達的突變體等分(fen)子(zi)生物學實驗對特(te)征(zheng)分(fen)子(zi)進行功能探索和(he)驗證。
案例(li)分享 在(zai)今天的分享環節(jie)，將向(xiang)大家展示如何利用蛋白質(zhi)組學(xue)技術深入探究(jiu)特定(ding)微(wei)生物(wu)的機制，并介紹其(qi)在(zai)植物(wu)學(xue)、醫學(xue)以及工業(ye)和食品等多個領域所取得的高水(shui)平研(yan)究(jiu)成(cheng)果。
文章一、植物領域 稻(dao)瘟(wen)病菌發育過程機制探(tan)索 標題(ti)：The phosphorylation landscape of infection-related development by the rice blast fungus 發表時間：2024年5月9日 發表期刊(kan)：cell（IF:64） 發(fa)表單位：英國塞恩斯伯里實(shi)驗室(shi) 主要(yao)技術手段：磷酸化(hua)修飾蛋(dan)白質組學(xue)、PRM靶向定量(liang)蛋(dan)白質組學(xue)、酵母(mu)雙(shuang)雜交、免疫共(gong)沉(chen)淀(dian) 研究背(bei)景： 水稻稻瘟(wen)(wen)病(bing)菌Magnaporthe oryzae通(tong)常會發(fa)育出一個黑色素沉著的附著胞(bao)，使病(bing)原(yuan)體能(neng)夠穿透植(zhi)物葉片表皮(pi)，引起病(bing)害，對全(quan)球糧食種植(zhi)產業(ye)構成了巨大威脅(xie)。以(yi)往研(yan)究表明附著胞(bao)形態(tai)發(fa)生需要一個MAPK信號(hao)通(tong)路，其中病(bing)原(yuan)性絲裂原(yuan)活化蛋白激(ji)酶1（Pmk1）MAPK是(shi)核(he)心組(zu)成部(bu)分。然(ran)而，這些下游Pmk1信號(hao)組(zu)分如何調節稻瘟(wen)(wen)病(bing)感染的分子機制仍然(ran)未知。 研究思路 （1）觀察野生型(xing)(xing)和Pmk1突(tu)變型(xing)(xing)稻(dao)瘟病菌附著孢子隨定(ding)植時間增加的表型(xing)(xing)和指標變化； （2）LFQ磷酸化蛋白質組學(xue)探究突變菌和野(ye)生(sheng)菌隨(sui)定植時間變化的蛋白情(qing)況(kuang)； （3）不同真菌磷酸化(hua)保守程度研究； （4）PRM靶向定量蛋(dan)白質(zhi)組學驗證Pmk1下(xia)游(you)靶標(biao)； （5）酵母雙(shuang)雜交和免疫共沉淀鎖(suo)定核心分子(zi)Vts1； （6）構(gou)建位點突變和(he)質(zhi)譜靶向驗證Pmk1影響Vts1生(sheng)物功能和(he)位點； 圖(tu)2 稻瘟病菌發育過程機制思路圖(tu) 結果速覽：研究人員以稻(dao)瘟病菌(jun)分生(sheng)孢(bao)子為研究對象，基于LFQ磷(lin)酸(suan)(suan)化蛋(dan)白質(zhi)組學（LC-MS/MS）分析(xi)了(le)(le)稻(dao)瘟病菌(jun)（Magnaporthe oryzae）感染(ran)相關(guan)的(de)發展(zhan)情況，探索了(le)(le)定(ding)植過(guo)程附著(zhu)孢(bao)Pmk1依賴的(de)分子機(ji)(ji)制(zhi)，結果顯示(shi)在(zai)疏水表面發芽后發現了(le)(le)2062個真(zhen)菌(jun)蛋(dan)白上的(de)8005個磷(lin)酸(suan)(suan)位點(dian)，揭(jie)示(shi)了(le)(le)附著(zhu)胞發育(yu)過(guo)程中磷(lin)酸(suan)(suan)化信(xin)號級聯(lian)的(de)重大重塑。比較(jiao)了(le)(le)41種不同致(zhi)病機(ji)(ji)理的(de)真(zhen)菌(jun)病原的(de)保守性磷(lin)酸(suan)(suan)化位點(dian)圖譜。然(ran)后，使用平(ping)行反應監測(ce)（PRM）來鑒真(zhen)菌(jun)感染(ran)植物(wu)Pmk1 MAPK調節的(de)磷(lin)蛋(dan)白，并(bing)通過(guo)體內外實驗鑒定(ding)并(bing)驗證了(le)(le)Pmk1的(de)關(guan)鍵靶標Vts1及其作用機(ji)(ji)制(zhi)。 圖3 稻瘟病菌致病機制部分結果圖
文章二、醫學領域 益生菌宿主互作調節腸道健康機(ji)制探索 標題：The secreted protein Amuc_1409 from Akkermansia muciniphila improves gut health through intestinal stem cell regulation 發表時(shi)間：2024年4月6日 發表(biao)期刊(kan)：Nature Communications（IF:16.6） 發表單位：韓國生物(wu)科學(xue)與生物(wu)技術研究所 主要技術手段(duan)：分泌蛋(dan)白(bai)組(zu)、免(mian)疫組(zu)化(hua)、qRT-PCR、免(mian)疫共(gong)沉淀 研究背景： Akkermansia muciniphila是腸(chang)道微(wei)生物(wu)群中最豐富的成員(yuan)之一，越來越多的證據支持其(qi)對維持腸(chang)道健康和改善(shan)(shan)炎癥以及改善(shan)(shan)肥(fei)胖、葡萄(tao)糖穩態和相(xiang)關并發癥的有(you)益(yi)作(zuo)用(yong)。其(qi)衍生的生物(wu)活性(xing)分子具有(you)靶(ba)向信號通(tong)路(lu)的潛在能力。因此，需要進一步的研究來了解宿主和A. muciniphila之間的相(xiang)互作(zuo)用(yong)。 研(yan)究思路： （1）分泌蛋白組(zu)發現Amuc_1409是A. muciniphila分泌中最常見的蛋白； （2）Amuc_1409通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進ISC介導的腸類器官(guan)上皮發育； （3）Amuc_1409通過促進ISC介導的再生來保護輻照或5-FU誘導的腸道(dao)損傷； （4）Amuc_1409恢復老化(hua)過程中ISCs的數量(liang)和功能； （5）Amuc_1409通過與(yu)E-cadherin相互(hu)作用促(cu)進E-cadherin/β-catenin復合物解(jie)離，從而(er)激活Wnt/β-catenin信(xin)號通路； （6） Amuc_1409以(yi)E-cadherin依賴的(de)(de)方式直接促進(jin)ISCs的(de)(de)再生(sheng)功能； 研究思路圖 圖4菌株關鍵因子調節腸道健康思路圖 結果(guo)速覽：此(ci)研究旨(zhi)在鑒定(ding)嗜粘(zhan)液(ye)芽孢桿菌中(zhong)新(xin)的(de)(de)(de)(de)益生(sheng)菌相(xiang)(xiang)關效應(ying)分(fen)(fen)子，并確定(ding)其(qi)功能。首(shou)先(xian)通過對(dui)不同培養條件下的(de)(de)(de)(de)上(shang)清進行(xing)分(fen)(fen)泌蛋白組質譜檢測，發現假定(ding)效應(ying)因子實驗(yan)發現Amuc_1409，通過體外腸(chang)(chang)道(dao)模型(xing)和(he)動物(wu)(wu)模型(xing)探索了(le)Amuc_1409治療(liao)體內放射或(huo)化(hua)療(liao)藥物(wu)(wu)誘(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)腸(chang)(chang)道(dao)損傷和(he)自然(ran)衰老過程種(zhong)中(zhong)增(zeng)加了(le)腸(chang)(chang)道(dao)干細胞(ISC)的(de)(de)(de)(de)增(zeng)殖和(he)再生(sheng)。機制上(shang)，通過體外結合(he)實驗(yan)發現Amuc_1409通過與(yu)E-cadherin相(xiang)(xiang)互作(zuo)用促進E-cadherin/β-catenin復合(he)物(wu)(wu)解離，從而激(ji)活Wnt/β-catenin信(xin)號通路。在腸(chang)(chang)道(dao)內穩態中(zhong)起著至(zhi)關重要的(de)(de)(de)(de)作(zuo)用，是(shi)一(yi)種(zhong)有希望(wang)改(gai)善和(he)維(wei)持腸(chang)(chang)道(dao)健康的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)分(fen)(fen)子。 圖5 菌(jun)株(zhu)關鍵因子調節腸道健康部分結(jie)果圖
文章三(san)、工業領域 硝(xiao)酸(suan)鹽(yan)調節(jie)微生物(wu)表面活性素(su)過量生產的機制 標題：Enhancing surfactin production in Bacillus subtilis: Insights from proteomic analysis of nitrate-induced overproduction and strategies for combinatorial metabolic engineering 發表時間：2024年2月27日 發表期刊：Bioresource Technology ( IF 11.4 ) 發表(biao)單位：天津大學 主要技術手段：蛋白(bai)質(zhi)組學、代謝工程 研(yan)究背景：表面(mian)活(huo)(huo)性素是一種(zhong)脂肽類生物(wu)表面(mian)活(huo)(huo)性劑，主要由(you)芽孢桿菌合成。由(you)于(yu)其具有(you)(you)降低溶液表面(mian)張力、生物(wu)可降解(jie)性和抗菌活(huo)(huo)性等(deng)優點，該化(hua)合物(wu)在農業和環境治理中具有(you)(you)巨大的應(ying)用潛(qian)力。近(jin)年(nian)來，有(you)(you)研(yan)究通(tong)過微生物(wu)發酵優化(hua)和菌株改良增(zeng)加了surfactin的產(chan)量，但surfactin產(chan)量仍有(you)(you)較大的提(ti)(ti)升空間。從蛋白質(zhi)組學出(chu)發解(jie)析特(te)定條件的改良對產(chan)量提(ti)(ti)升機制有(you)(you)非常重要的意義。 研究思(si)路(lu)： （1）探索枯草芽孢桿菌不同的(de)發酵環境條(tiao)件對(dui)surfactin生產(chan)的(de)影響； （2）蛋(dan)白質(zhi)組學分(fen)析(xi)篩查surfactin代(dai)謝(xie)相關蛋(dan)白； （3）使用P43啟動(dong)子(zi)對(dui)候選靶點(dian)(narG、narH和cypC)進行過表達，產量提升(sheng)，增強硝酸鹽的還原代(dai)謝和脂肪酸底物的羥基化作用； （4）使用P43啟(qi)動子分別過表達SecA、FtsY和FtsE，轉運蛋(dan)白（SecA、FtsY和FtsE）的聯合(he)過表達大(da)幅(fu)提高了表面活性素的產量； （5）投(tou)喂外源性飼料（膜轉(zhuan)運(yun)體相(xiang)關(guan)物(wu)(wu)質（海藻糖）、碳相(xiang)關(guan)代謝物(wu)(wu)（半乳糖和丙酮酸(suan)(suan)）和脂肪(fang)酸(suan)(suan)相(xiang)關(guan)代謝的特(te)定物(wu)(wu)質（醋酸(suan)(suan)鈉和油酸(suan)(suan)）以(yi)提高表(biao)面(mian)活(huo)性素(su)的產量； 圖6硝酸鹽調節微(wei)生物surfactin產量研究思路圖 結果(guo)速覽(lan)：研究人員發現添加氮源（硝酸鹽）提(ti)高了枯(ku)草芽孢桿菌(jun)的(de)表面活(huo)性(xing)素(su)的(de)產(chan)量(liang)。通(tong)過蛋白質(zhi)組學分(fen)析揭示(shi)了硝酸鹽誘(you)導(dao)表面活(huo)性(xing)素(su)過量(liang)產(chan)生的(de)機制，確定了與(yu)(yu)表面活(huo)性(xing)素(su)轉運和(he)調(diao)控相關的(de)三個(ge)關鍵(jian)差異蛋白（前蛋白轉位酶亞基SecA、信號識別粒子(zi)受(shou)體FtsY和(he)細胞(bao)分(fen)裂(lie)三磷(lin)酸腺苷結合(he)(he)蛋白FtsE）。通(tong)過組合(he)(he)代謝工(gong)程策略構(gou)建的(de)工(gong)程菌(jun)株(zhu)（增強硝酸鹽還原、脂肪(fang)酸羥(qian)基化(hua)、合(he)(he)理(li)轉運體工(gong)程和(he)喂養）與(yu)(yu)野生型(xing)菌(jun)株(zhu)相比，表面活(huo)性(xing)素(su)的(de)產(chan)量(liang)增加了41.4倍(bei)。這項研究提(ti)供(gong)了硝酸鹽誘(you)導(dao)表面活(huo)性(xing)素(su)過量(liang)生產(chan)的(de)分(fen)子(zi)機制以及(ji)提(ti)高活(huo)性(xing)素(su)產(chan)生菌(jun)株(zhu)性(xing)能的(de)策略。 圖(tu)(tu)7硝(xiao)酸(suan)鹽調節(jie)微生物surfactin產(chan)量部分結果(guo)圖(tu)(tu)
文章(zhang)四、食品領(ling)域 食品添加劑(ji)抑制病原菌生長(chang)機制 標題：Integration analysis of transcriptomics and proteomics reveals the inhibitory effect of carvacrol on Alternaria alternata by interfering with carbohydrate metabolism 發表(biao)時間：2024年(nian)4月09日(ri) 發表期(qi)刊：Postharvest Biology and Technology (IF 7.0) 發表(biao)單位：北方民族大學 主要(yao)技術手段：透射電鏡、蛋(dan)白(bai)質(zhi)組學、轉錄組學、PRM靶向定量(liang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)組學 研究背(bei)景：真菌(jun)(jun)感染是水(shui)果(guo)和蔬菜收(shou)獲后(hou)變(bian)質的(de)(de)主要原因，香(xiang)芹(qin)酚（CVR）在體外具有抗真菌(jun)(jun)特(te)性(xing)，CVR處理可(ke)以抑制細胞壁多糖(tang)的(de)(de)合成(cheng)以及幾(ji)丁質和葡聚糖(tang)的(de)(de)代謝，從(cong)而抑制鏈格孢(bao)(bao)菌(jun)(jun)的(de)(de)生長，已(yi)被批準(zhun)為安全的(de)(de)食品添加劑(ji)。破壞(huai)碳水(shui)化合物(wu)(wu)的(de)(de)生物(wu)(wu)合成(cheng)是開發新(xin)型治療劑(ji)的(de)(de)一種有前途且高度特(te)異性(xing)的(de)(de)方(fang)法，然而，目前尚不清楚(chu)CVR處理對鏈格孢(bao)(bao)菌(jun)(jun)整(zheng)體碳水(shui)化合物(wu)(wu)代謝的(de)(de)影(ying)響機制。 研究(jiu)思路： （1）電鏡觀察CVR降(jiang)低了鏈格(ge)孢菌的糖原儲存(cun)、幾丁質分布和細胞壁厚度； （2）探(tan)究CVR對鏈格孢菌含糖量的影(ying)響(xiang)； （3）蛋白質組(zu)學和轉(zhuan)錄組(zu)學檢測(ce)和生信分析發(fa)現碳水化合物代謝在真菌(jun)細(xi)胞的(de)生長和存活中起著至關重要的(de)作用； （4）PRM蛋白(bai)質組學和(he)qRT-PCR驗(yan)證表達情況； （5）蛋白代謝(xie)聯(lian)合(he)分析解析CVR對菌(jun)絲體碳(tan)水化合(he)物代謝(xie)影響的分子機制； （6）測試CVR處理降低了鏈(lian)格孢菌對纖維素、蔗糖、淀粉和果膠的利(li)用能(neng)力(li)； 圖8 食品添加劑抑(yi)制(zhi)病原(yuan)菌生(sheng)長機制(zhi)思路(lu)圖 結(jie)果(guo)速覽：研究者(zhe)發(fa)現CVR處理(li)(li)降低了(le)(le)鏈(lian)格(ge)(ge)孢菌(jun)的細胞壁厚(hou)度、幾(ji)丁質和(he)β-1,3-葡聚(ju)糖(tang)分布、糖(tang)原積累以及總糖(tang)、三鹵糖(tang)、甘露糖(tang)、果(guo)糖(tang)和(he)半乳糖(tang)含量(liang)。蛋白質組(zu)分析表明，CVR處理(li)(li)加速了(le)(le)鏈(lian)格(ge)(ge)孢菌(jun)細胞壁多(duo)糖(tang)的分解(jie)，阻礙了(le)(le)蔗糖(tang)的消耗，破壞了(le)(le)糖(tang)酵解(jie)途徑(jing)，并促進了(le)(le)與抗逆性相(xiang)關的碳(tan)(tan)水化合(he)(he)物的分解(jie)。此(ci)外，碳(tan)(tan)源培養的結(jie)果(guo)表明，CVR會(hui)影(ying)響碳(tan)(tan)水化合(he)(he)物的代謝，而碳(tan)(tan)水化合(he)(he)物的代謝與鏈(lian)格(ge)(ge)孢菌(jun)的生(sheng)長、感染(ran)和(he)抗逆性有關。 圖(tu)9食品添(tian)加劑(ji)抑制病原(yuan)菌(jun)生(sheng)長機(ji)制部分結果圖(tu)
參考文獻： 1.Cruz-Mireles N, Osés-Ruiz M, Derbyshire P, et al. The phosphorylation landscape of infection-related development by the rice blast fungus. Cell. 2024;187(10):2557-2573.e18. doi:10.1016/j.cell.2024.04.007 2.Kang EJ, Kim JH, Kim YE, et al. The secreted protein Amuc_1409 from Akkermansia muciniphila improves gut health through intestinal stem cell regulation. Nat Commun. 2024;15(1):2983. Published 2024 Apr 6. doi:10.1038/s41467-024-47275-8 3.Xia L, Hou Z, Zhu F, Wen J. Enhancing surfactin production in Bacillus subtilis: Insights from proteomic analysis of nitrate-induced overproduction and strategies for combinatorial metabolic engineering. Bioresour Technol. 2024;397:130499. doi:10.1016/j.biortech.2024.130499 4.Zhao L, Wang J J, Zhang H Y, et al. Integration analysis of transcriptomics and proteomics reveals the inhibitory effect of carvacrol on Alternaria alternata by interfering with carbohydrate metabolism[J]. Postharvest Biology and Technology, 2024; 213, 112928. doi:10.1016/j.postharvbio.2024.112928.
