接(jie)下來(lai)，帶大家解析(xi)這篇文章：

為(wei)了(le)利用(yong)現(xian)有的(de)(de)微流控單細胞測序平臺，作者(zhe)設計(ji)了(le)一(yi)種(zhong)用(yong)DNA探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)標記(ji)單個(ge)轉(zhuan)錄(lu)(lu)本的(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)。首先(xian)，通過生信軟件或(huo)(huo)已發表的(de)(de)寡核苷酸陣列中確(que)定獨特的(de)(de)50bp mRNA 結(jie)合序列，作為(wei)單鏈DNA探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)靶區(qu)，探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)組(zu)成包括用(yong)于后續(xu)(xu)5' PCR擴增(zeng)(zeng)的(de)(de)PCR Handle、通過序列互補與(yu)相應PCR雜(za)交的(de)(de)結(jie)合區(qu)、唯一(yi)分子標識符（UMI）、3' poly-A尾(wei)。為(wei)每個(ge)基(ji)因(yin)設計(ji)了(le)多個(ge)探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)（互補于不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)區(qu)域），以提(ti)高轉(zhuan)錄(lu)(lu)捕獲(huo)效率(lv)并減少因(yin)雜(za)交不(bu)(bu)良或(huo)(huo)任何給(gei)定探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)擴增(zeng)(zeng)不(bu)(bu)足而引(yin)起(qi)的(de)(de)背景噪音。選擇phi29 DNA 聚合酶進行滾環(huan)(huan)擴增(zeng)(zeng)（RCA），該方(fang)法(fa)(fa)在(zai)產(chan)生足量單鏈DNA產(chan)物進行scRNA-seq的(de)(de)同(tong)時，不(bu)(bu)易像傳統PCR那樣產(chan)生復合錯(cuo)誤。在(zai)探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)制備(bei)的(de)(de)最后一(yi)步時，通過引(yin)物擴展將UMI和poly-A尾(wei)添加(jia)到原探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)3 '端。滾環(huan)(huan)擴增(zeng)(zeng)方(fang)法(fa)(fa)允許重新擴增(zeng)(zeng)探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)組(zu)，用(yong)于無限制的(de)(de)后續(xu)(xu)實驗，而無需重新訂購探(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)。

探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)制備完成(cheng)后(hou)，將細菌固定(ding)在(zai) 1% 多聚(ju)甲醛中，并(bing)通過(guo)溫和的溶(rong)菌酶處(chu)理(li)進行透(tou)化(hua)以(yi)允許(xu)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)穿透(tou)，然后(hou)將相應的DNA探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)與透(tou)化(hua)細菌孵(fu)育以(yi)雜交到(dao)固定(ding)化(hua)的mRNA，并(bing)通過(guo)洗(xi)滌去除未雜交或錯誤雜交的探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)。選(xuan)擇一定(ding)量處(chu)理(li)后(hou)細胞與PCR試劑和引物混合，利用(yong)10×Genomics微流控(kong)裝置生成(cheng)液(ye)滴(di)，建庫(ku)(ku)生成(cheng)3' 單細胞轉錄(lu)組文庫(ku)(ku)。

圖1 ProBac-seq方法與驗證

為(wei)驗證ProBac-seq能否表(biao)(biao)征(zheng)細胞(bao)(bao)的(de)(de)轉(zhuan)錄狀態(tai)，作(zuo)者將(jiang)晚期枯草芽孢桿菌(jun)等分(fen)(fen)(fen)為(wei)兩份(fen)，分(fen)(fen)(fen)別使(shi)用SMART-seq和ProBac-seq進行處理，結(jie)果(guo)表(biao)(biao)明，50℃條(tiao)件(jian)下(xia)利用雜(za)交探(tan)針得到文庫結(jie)果(guo)與SMART-seq文庫結(jie)果(guo)相似（圖(tu)1d）。為(wei)驗證通(tong)過(guo)(guo)10×Genomics是否可以通(tong)過(guo)(guo)封裝單個細菌(jun)進行單細胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄組測序，將(jiang)大(da)腸(chang)桿菌(jun)和枯草芽孢桿菌(jun)細胞(bao)(bao)進行獨立固定，并用對應于(yu)其各自基因(yin)組的(de)(de)探(tan)針進行預處理，將(jiang)制備好的(de)(de)樣本與帶有DNA引物的(de)(de)PCRMIX混合，上10×Genomics生成(cheng)油包水(shui)后進行建庫，結(jie)果(guo)表(biao)(biao)明，微流控平臺可以成(cheng)功地(di)通(tong)過(guo)(guo)Barcode區分(fen)(fen)(fen)不(bu)同細菌(jun)的(de)(de)單個細胞(bao)(bao)（圖(tu)1e），同時(shi)發現兩個樣本捕獲(huo)探(tan)針的(de)(de)豐度高(gao)度相關，說明來自單細胞(bao)(bao)的(de)(de)信號提(ti)供了轉(zhuan)錄狀態(tai)的(de)(de)良好表(biao)(biao)征(zheng)（圖(tu)1f）。

為了證(zheng)明ProBac-seq對異質(zhi)性(xing)研究(jiu)的(de)廣泛應用，作者利(li)用ProBac-seq對不同類型微生物種(zhong)群進行單細胞測序分(fen)析：

1、ProBac-seq鑒定枯草芽孢桿菌的異(yi)質性

作者在(zai)(zai)添加蘋果酸的(de)(de)M9基(ji)礎培養基(ji)中(zhong)(zhong)選擇指數(shu)后期的(de)(de)枯草(cao)芽孢(bao)桿(gan)菌(jun)進行ProBac-seq，捕獲(huo)2784個(ge)細胞(bao)，分析得到(dao)由10個(ge)細胞(bao)簇組(zu)成的(de)(de)四種不同轉錄組(zu)特征（圖(tu)2a、b）。與作者預期一致的(de)(de)是(shi)，觀(guan)察到(dao)了(le)具有遺傳能力特征的(de)(de)細胞(bao)亞群（簇 6 和(he) 8）。探(tan)針靶向的(de)(de) 50 個(ge) comK 調控子基(ji)因(yin)中(zhong)(zhong)有 45 個(ge)在(zai)(zai)簇 6 和(he) 8 中(zhong)(zhong)差異過表達（圖(tu)2c、d）。

總而言之，利用(yong)ProBac-seq對枯草芽孢桿菌進行分析，不僅可以(yi)獲得已知的(de)(de)細胞狀態(tai)，并且能夠識別(bie)以(yi)前未報道(dao)的(de)(de)細胞狀態(tai)，揭示(shi)潛在基因組結構的(de)(de)特征。

圖2 ProBac-seq分析揭示(shi)了枯草芽孢桿菌的(de)不同轉錄狀態

2、克隆大腸桿菌(jun)群體中(zhong)的(de)表達異質(zhi)性

作者使用ProBac-seq來表征大(da)腸桿(gan)(gan)菌MG1655的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄異質性，該菌在M9基(ji)礎培養(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)生(sheng)長，并(bing)化學固(gu)定在對數中(zhong)(zhong)期。捕(bu)獲3315 個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，通過(guo)聚類將(jiang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分為9個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)簇（圖(tu)3a、b），作者發現(xian)與枯草芽孢桿(gan)(gan)菌相似的(de)(de)(de)(de)是，某些(xie)簇可(ke)以通過(guo)DGE分配給特(te)定的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)過(guo)程，例(li)如簇 1 中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)獨(du)特(te)地上調(diao)與細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)運動有(you)關(guan)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)，鞭毛(mao)關(guan)鍵(jian)基(ji)因(yin)（鞭毛(mao)蛋(dan)白，fliC）優先由簇1中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)表達（圖(tu)3c）；簇 5、6 和(he) 7 中(zhong)(zhong)顯(xian)示出(chu)氨基(ji)甲酰磷(lin)酸酯的(de)(de)(de)(de)不同用途；簇 8 中(zhong)(zhong) fimI、fimC 和(he) fimA 的(de)(de)(de)(de)顯(xian)著上調(diao)，而fim 操縱子的(de)(de)(de)(de)下游基(ji)因(yin)編碼(ma)Ⅰ型菌毛(mao)的(de)(de)(de)(de)成分，這些(xie)成分與生(sheng)物(wu)(wu)膜的(de)(de)(de)(de)形成和(he)致病(bing)性有(you)關(guan)，并(bing)且已知是異質表達的(de)(de)(de)(de)。為了證實細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞(ya)群的(de)(de)(de)(de)存在，使用Remel Flagella染色(se)劑對在相同條(tiao)件下生(sheng)長的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進行染色(se)并(bing)觀察（圖(tu)3d），結果(guo)發現(xian)大(da)約36 %的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)具有(you)組裝的(de)(de)(de)(de)鞭毛(mao)，這一(yi)比例(li)高于在簇1中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)14.5%，導致結果(guo)差異的(de)(de)(de)(de)原因(yin)可(ke)能是一(yi)些(xie)有(you)鞭毛(mao)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可(ke)能已經退出(chu)轉(zhuan)錄狀(zhuang)態，但仍然保留(liu)了翻譯的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白質產物(wu)(wu)。

綜上所述(shu)，作者對大腸(chang)桿(gan)菌(jun)和枯(ku)草芽孢桿(gan)菌(jun)的(de)觀察表(biao)明(ming)，廣泛的(de)表(biao)型異質性(xing)是細(xi)菌(jun)的(de)一般特(te)征，精氨酸代謝等(deng)過程通(tong)常局限于特(te)殊細(xi)胞。此(ci)外(wai)，與毒力相關(guan)的(de)基因分(fen)離到特(te)定的(de)細(xi)胞群中，表(biao)明(ming)特(te)定的(de)細(xi)胞類型可能與致病性(xing)有(you)關(guan)。

圖3 在基(ji)(ji)礎培養基(ji)(ji)中生長的(de)大腸桿菌的(de)異質(zhi)基(ji)(ji)因表達

3、產氣莢(jia)膜(mo)梭菌(jun)毒素表(biao)達異(yi)質性

為(wei)了驗證ProBac-seq能(neng)否在真正的(de)(de)(de)病原(yuan)體(ti)中(zhong)鑒定(ding)不同細胞(bao)亞群(qun)，作者選擇產(chan)氣(qi)莢(jia)(jia)膜梭(suo)菌研究其(qi)毒素(su)的(de)(de)(de)產(chan)生(sheng)，產(chan)氣(qi)莢(jia)(jia)膜梭(suo)菌是一種革蘭(lan)氏陽性孢子(zi)形成細菌，是人類和牲畜的(de)(de)(de)重要(yao)病原(yuan)體(ti)，導(dao)致(zhi)壞(huai)死(si)性腸(chang)炎的(de)(de)(de)A型產(chan)氣(qi)莢(jia)(jia)膜梭(suo)菌的(de)(de)(de)毒力(li)因子(zi)為(wei)NetB。通(tong)過(guo)BHI培養基中(zhong)生(sheng)長至(zhi)指數期(qi)晚(wan)期(qi)的(de)(de)(de)產(chan)氣(qi)莢(jia)(jia)膜梭(suo)菌進行單細胞(bao)分析，捕獲1508個細胞(bao)，通(tong)過(guo)聚類將細胞(bao)分為(wei)4個細胞(bao)簇(cu)（圖4a）。雖然NetB在所有簇(cu)中(zhong)都有表達，但NetB差異過(guo)表達定(ding)義了簇(cu)0（占(zhan)比43%）。

產(chan)(chan)氣(qi)莢膜(mo)(mo)梭菌(jun)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)另一種外毒(du)(du)素 pfoA 的(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)(chan)生已被(bei)證(zheng)明受(shou)短(duan)鏈(lian)脂肪酸（如乙(yi)(yi)酸鹽(yan)(yan)和丁酸鹽(yan)(yan)）的(de)(de)(de)(de)(de)調節，短(duan)鏈(lian)脂肪酸在(zai)胃(wei)腸道中(zhong)(zhong)含量豐富，并已被(bei)證(zheng)明可以抑制 pfoA 外毒(du)(du)素，控制脂肪酸降解的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)在(zai)NetB過表(biao)達(da)(da)簇中(zhong)(zhong)上調，因(yin)此作者假(jia)設(she)乙(yi)(yi)酸鹽(yan)(yan)可用于(yu)降低(di)產(chan)(chan)氣(qi)莢膜(mo)(mo)梭菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)NetB 表(biao)達(da)(da)。為(wei)了驗證(zheng)假(jia)設(she)，作者在(zai)培養產(chan)(chan)氣(qi)莢膜(mo)(mo)梭菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)培養基(ji)中(zhong)(zhong)加(jia)入乙(yi)(yi)酸鈉來擾亂產(chan)(chan)氣(qi)莢膜(mo)(mo)梭菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)外環境，并選擇指數后期的(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)(chan)氣(qi)莢膜(mo)(mo)梭菌(jun)進行ProBac-seq，結果發現，NetB 的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)再(zai)次集中(zhong)(zhong)在(zai)簇 0 中(zhong)(zhong)，其中(zhong)(zhong)與未處(chu)理(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)相(xiang)比，用乙(yi)(yi)酸鹽(yan)(yan)處(chu)理(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)表(biao)達(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)素顯著(zhu)減(jian)少(shao)(shao)，乙(yi)(yi)酸鹽(yan)(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)添加(jia)顯著(zhu)降低(di)了處(chu)于(yu)初級產(chan)(chan)毒(du)(du)狀態（簇0）的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)比例(li)從43%降低(di)到30%（圖4c），毒(du)(du)素基(ji)因(yin)表(biao)達(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)減(jian)少(shao)(shao)與在(zai)含有乙(yi)(yi)酸鹽(yan)(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)培養基(ji)中(zhong)(zhong)生長的(de)(de)(de)(de)(de)培養物中(zhong)(zhong)分泌的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)外NetB蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)減(jian)少(shao)(shao)一致(zhi)。

綜上所(suo)述，NetB由專門的(de)細(xi)胞亞(ya)群差異表達(da)，并且提供有利于替(ti)代細(xi)胞狀態的(de)生長條件可以降(jiang)低克隆細(xi)菌群體中毒(du)力細(xi)胞的(de)比(bi)例。

圖4 產(chan)氣莢(jia)膜(mo)梭(suo)菌中(zhong)的NetB毒素優先由細(xi)胞亞群表達，并可通過添加乙酸鹽下調表達

綜上(shang)所述(shu)，ProBac-seq研究細(xi)菌(jun)群落(luo)的(de)(de)(de)(de)異質(zhi)性(xing)的(de)(de)(de)(de)優勢(shi)在(zai)于(yu)，它為(wei)研究數(shu)(shu)千個(ge)單細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)全基(ji)因組(zu)表(biao)(biao)達水平提供(gong)了(le)一種無(wu)偏倚的(de)(de)(de)(de)方法，從而可以全面(mian)分(fen)析基(ji)因-基(ji)因和細(xi)胞(bao)(bao)-細(xi)胞(bao)(bao)相(xiang)關(guan)性(xing)，最大限度地捕獲轉(zhuan)(zhuan)錄本，避免(mian)核糖體RNA干擾(rao)。在(zai)ProBac-seq中(zhong)，由于(yu)同(tong)一探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)多個(ge)拷貝不能在(zai)任何給定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)錄本上(shang)占據(ju)相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)(de)位置(zhi)，并(bing)(bing)且測(ce)(ce)序文庫(ku)直接(jie)(jie)由雜交(jiao)的(de)(de)(de)(de)DNA探(tan)針(zhen)(zhen)制成，而不產生(sheng)cDNA，因此歸一化UMI的(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)量與每個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)存在(zai)的(de)(de)(de)(de)mRNA靶標(biao)的(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)量直接(jie)(jie)相(xiang)關(guan)。此外(wai)，針(zhen)(zhen)對每個(ge)轉(zhuan)(zhuan)錄本不同(tong)區域的(de)(de)(de)(de)多個(ge)探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)設(she)(she)計(ji)允許檢測(ce)(ce)任何給定(ding)(ding)(ding) mRNA 分(fen)子的(de)(de)(de)(de)更高機會(hui)，并(bing)(bing)為(wei)每個(ge)轉(zhuan)(zhuan)錄本提供(gong)額外(wai)的(de)(de)(de)(de)獨立測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)，可用(yong)于(yu)為(wei)低水平表(biao)(biao)達的(de)(de)(de)(de)基(ji)因獲得(de)足夠的(de)(de)(de)(de)統(tong)計(ji)意義(yi)。但同(tong)時也存在(zai)一定(ding)(ding)(ding)局(ju)(ju)限性(xing)，例如，依(yi)賴于(yu)探(tan)針(zhen)(zhen)雜交(jiao)，需要基(ji)因組(zu)的(de)(de)(de)(de)先驗知識以及設(she)(she)計(ji)和訂(ding)購大量探(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)前期(qi)成本，同(tong)時依(yi)賴于(yu)10×平臺。但盡管存在(zai)這些局(ju)(ju)限性(xing)，ProBac-seq仍(reng)具(ju)有快(kuai)速(su)、經濟高效的(de)(de)(de)(de)特點(dian)，并(bing)(bing)可生(sheng)成具(ju)有準確(que)轉(zhuan)(zhuan)錄本定(ding)(ding)(ding)量的(de)(de)(de)(de)高分(fen)辨(bian)率數(shu)(shu)據(ju)集。