2024-07-06
前言 5mC(5-甲基胞(bao)嘧啶(ding))和(he)5hmC(羥甲基胞(bao)嘧啶(ding))是基因(yin)組(zu)DNA中(zhong)最(zui)常見且在表(biao)觀遺傳(chuan)調(diao)控中(zhong)扮演重(zhong)要角色的(de)(de)(de)兩種修飾形式。一般通(tong)過(guo)塑造(zao)染色質狀態(tai)、影響轉錄因(yin)子結(jie)合等(deng)方式調(diao)控基因(yin)表(biao)達，引起細(xi)胞(bao)表(biao)型和(he)功能上(shang)的(de)(de)(de)變化，在細(xi)胞(bao)分化、發育及(ji)疾病發生過(guo)程中(zhong)發揮重(zhong)要作用。同(tong)時解(jie)析(xi)基因(yin)組(zu)DNA上(shang)5mC和(he)5hmC的(de)(de)(de)分布和(he)動態(tai)關(guan)聯(lian)是研(yan)究DNA甲基化動態(tai)變化的(de)(de)(de)功能及(ji)其調(diao)控機制(zhi)的(de)(de)(de)關(guan)鍵。但是目前沒有在單細(xi)胞(bao)水平上(shang)解(jie)析(xi)5mC和(he)5hmC的(de)(de)(de)實驗技術。
PART01、技術路(lu)線 北京(jing)大(da)學(xue)伊(yi)成器及(ji)康(kang)奈爾大(da)學(xue)朱晨旭共同(tong)通訊在(zai)Nature Biotechnology上發表題為(wei)“Simultaneous single-cell analysis of 5mC and 5hmC with SIMPLE-seq”的文獻，該(gai)研究提(ti)出了一(yi)種在(zai)單細(xi)胞(bao)、單分子(zi)水平上同(tong)時檢(jian)測(ce)5mC和5hmC的測(ce)序(xu)技術(shu)—SIMPLE-seq。該(gai)技術(shu)使用(yong)兩(liang)個正(zheng)交標(biao)(biao)記(ji)(ji)步驟將靶(ba)向修飾(shi)(5mC和5hmC）轉化為(wei)兩(liang)種胸腺嘧(mi)啶(T)類(lei)似物，在(zai)每個標(biao)(biao)記(ji)(ji)步驟之后，利用(yong)DNA聚合(he)酶延伸(shen)(shen)反(fan)(fan)應記(ji)(ji)錄轉化產物中的堿基(ji)突變(bian)(bian)(bian)信(xin)號(hao)(hao)(5mC-to-T，5hmC-to-T)。同(tong)時引入帶有修飾(shi)堿基(ji)的標(biao)(biao)記(ji)(ji)序(xu)列(lie)并利用(yong)其(qi)伴(ban)隨（C-to-T）產生(sheng)的突變(bian)(bian)(bian)信(xin)號(hao)(hao)對5mC和5hmC的突變(bian)(bian)(bian)信(xin)息進行拆分，實現(xian)同(tong)時檢(jian)測(ce)同(tong)一(yi)條DNA分子(zi)上的5mC和5hmC。為(wei)了區分來自兩(liang)個標(biao)(biao)記(ji)(ji)反(fan)(fan)應的突變(bian)(bian)(bian)信(xin)號(hao)(hao)，使用(yong)具有指示序(xu)列(lie)的特殊引物：來自5hmC標(biao)(biao)記(ji)(ji)步驟的延伸(shen)(shen)產物將進行第二(er)次5mC標(biao)(biao)記(ji)(ji)反(fan)(fan)應以產生(sheng)突變(bian)(bian)(bian)的指示序(xu)列(lie)；相(xiang)反(fan)(fan)源自5mC標(biao)(biao)記(ji)(ji)的產品保留了原始指示序(xu)列(lie)。除此之外，研究團(tuan)隊(dui)將該(gai)流程(cheng)與細(xi)胞(bao)組合(he)標(biao)(biao)簽技術(shu)相(xiang)結合(he)，可(ke)實現(xian)高通量、單細(xi)胞(bao)、全基(ji)因組水平的5mC和5hmC測(ce)序(xu)，如(ru)圖1所示。 圖1 SIMPLE-seq實驗(yan)技術(shu)原理圖
PART02、性能驗(yan)證 作者首先將SIMPLE-seq技術(shu)應用(yong)于研究不(bu)(bu)同(tong)干(gan)性培(pei)養條(tiao)件(jian)下小鼠(shu)胚胎干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)表觀(guan)圖(tu)譜差異，在單(dan)分(fen)(fen)子水平上(shang)(shang)鑒定(ding)了(le)5mC和(he)(he)5hmC的(de)(de)(de)分(fen)(fen)布關(guan)(guan)系，解析了(le)兩(liang)種干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)狀(zhuang)態(tai)(tai)下DNA表觀(guan)遺傳圖(tu)譜的(de)(de)(de)重編(bian)程變化，如圖(tu)2所(suo)示(shi)。觀(guan)察到(dao)來自一(yi)(yi)致(zhi)和(he)(he)不(bu)(bu)一(yi)(yi)致(zhi)基序組的(de)(de)(de)相似數(shu)量的(de)(de)(de)TFs與TF基因(yin)表達(da)水平呈正(zheng)負相關(guan)(guan)，表明(ming)5mC和(he)(he)5hmC對TF結合和(he)(he)調(diao)控輸出(chu)的(de)(de)(de)明(ming)顯(xian)而復雜的(de)(de)(de)影(ying)響。除(chu)此之外發現這兩(liang)組的(de)(de)(de)小鼠(shu)胚胎干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在5hmC上(shang)(shang)比在5mC上(shang)(shang)可以更明(ming)顯(xian)地相互分(fen)(fen)離，同(tong)時(shi)這種細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)間5mC和(he)(he)5hmC的(de)(de)(de)明(ming)顯(xian)異質性促使我們分(fen)(fen)析單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中5mC-5hmC的(de)(de)(de)關(guan)(guan)系。最終揭(jie)(jie)示(shi)了(le)與活性染色(se)質相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)多(duo)種5hmC類型，同(tong)時(shi)也表明(ming)了(le)SIMPLE-seq在揭(jie)(jie)示(shi)小鼠(shu)胚胎干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)不(bu)(bu)同(tong)狀(zhuang)態(tai)(tai)轉換(huan)過程中與不(bu)(bu)同(tong)調(diao)節(jie)功能相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)不(bu)(bu)同(tong)5hmC類型的(de)(de)(de)效果。 圖2 同一(yi)分子的(de)5mC和5hmC的(de)分析結(jie)果(guo) 除此之(zhi)外，作者還將SIMPLE-seq技(ji)術(shu)應用于(yu)分析細(xi)胞(bao)組(zu)成復雜(za)的(de)(de)組(zu)織(zhi)樣(yang)本(ben)，包括(kuo)繪制了(le)約3000個(ge)人外周血(xue)單個(ge)核(he)細(xi)胞(bao)以(yi)及6000個(ge)小鼠大腦皮(pi)層細(xi)胞(bao)的(de)(de)DNA甲(jia)基化(hua)和(he)(he)羥(qian)甲(jia)基化(hua)圖(tu)譜，如圖(tu)3和(he)(he)圖(tu)4所示(shi)。作者結合(he)兩類表觀遺傳修飾鑒定得(de)到精確的(de)(de)細(xi)胞(bao)分型結果，探(tan)究了(le)5mC和(he)(he)5hmC與轉錄因子結合(he)、組(zu)蛋白修飾、基因表達等其他組(zu)學(xue)之(zhi)間的(de)(de)關(guan)系(xi)，展示(shi)了(le)SIMPLE-seq在多(duo)種(zhong)復雜(za)生(sheng)物學(xue)樣(yang)本(ben)中鑒定不同細(xi)胞(bao)類型和(he)(he)狀態的(de)(de)能(neng)力(li)，體現了(le)DNA甲(jia)基化(hua)和(he)(he)羥(qian)甲(jia)基化(hua)聯合(he)分析的(de)(de)巨大潛力(li)和(he)(he)廣泛應用場景。 圖(tu)3 人PBMC中細胞類型(xing)特異性的5mC和5hmC圖(tu)譜 圖4 小鼠腦5mC和5hmC的單細胞圖譜
綜(zong)上(shang)所述, SIMPLE-seq是(shi)一種(zhong)在(zai)單(dan)細胞(bao)、單(dan)分(fen)子(zi)水平(ping)上(shang)同時檢測基因組(zu)DNA甲基化和(he)羥(qian)甲基化的(de)(de)新技術, 可以在(zai)復(fu)雜(za)(za)生(sheng)物學樣(yang)本和(he)復(fu)雜(za)(za)生(sheng)物學過程中(zhong)檢測多種(zhong)細胞(bao)類型的(de)(de)基因組(zu)DNA表觀遺傳(chuan)修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)全景圖譜。除此之(zhi)外(wai)，可進一步(bu)與轉錄組(zu)、組(zu)蛋白修(xiu)(xiu)飾、染色質(zhi)可及性或染色體構(gou)象分(fen)析相(xiang)結合，以擴大綜(zong)合細胞(bao)分(fen)析的(de)(de)范圍。
