單(dan)(dan)(dan)細(xi)胞測(ce)序技(ji)(ji)術(shu)自2009年(nian)問世，2013年(nian)被Nature Methods評為年(nian)度技(ji)(ji)術(shu)以(yi)(yi)來(lai)(lai)，越來(lai)(lai)越多地(di)(di)被應用在科(ke)研(yan)(yan)領域。2015年(nian)以(yi)(yi)來(lai)(lai)，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等(deng)技(ji)(ji)術(shu)的出現，徹底降(jiang)低(di)了單(dan)(dan)(dan)細(xi)胞測(ce)序的成本(ben)門檻(jian)。自此，單(dan)(dan)(dan)細(xi)胞測(ce)序技(ji)(ji)術(shu)被廣泛應用于(yu)(yu)基(ji)礎科(ke)研(yan)(yan)和臨床(chuang)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)，單(dan)(dan)(dan)細(xi)胞在許(xu)多領域都占有(you)一席之地(di)(di)，對于(yu)(yu)癌癥早(zao)期的診(zhen)斷、追(zhui)蹤(zong)以(yi)(yi)及(ji)個體化治療具有(you)重要意義。近些年(nian)來(lai)(lai)，隨著單(dan)(dan)(dan)細(xi)胞測(ce)序技(ji)(ji)術(shu)測(ce)序通(tong)量的提(ti)高以(yi)(yi)及(ji)測(ce)序成本(ben)的降(jiang)低(di)，單(dan)(dan)(dan)細(xi)胞測(ce)序技(ji)(ji)術(shu)在醫藥(yao)、農學(xue)(xue)、水產等(deng)各個領域均有(you)著廣泛的研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)，下面通(tong)過4篇(pian)文獻來(lai)(lai)助(zhu)您(nin)打開單(dan)(dan)(dan)細(xi)胞測(ce)序在免疫學(xue)(xue)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)中的應用思(si)路~

由于胰腺(xian)導管腺(xian)癌（PDAC）對(dui)包括免疫檢(jian)查(cha)點封(feng)鎖在(zai)(zai)內的治療方法表(biao)現(xian)出耐(nai)藥性，因此(ci)(ci)患者(zhe)的預后仍然(ran)很嚴(yan)峻。有(you)趣的是(shi)，微生物群似乎會(hui)影響 PDAC 的結(jie)果。在(zai)(zai)長(chang)期(qi)的 PDAC 幸存(cun)(cun)者(zhe)中，微生物組多樣(yang)性的增加與腫瘤(liu)(liu)微環境（TME）的生存(cun)(cun)率和免疫學特(te)征相(xiang)關。此(ci)(ci)外，在(zai)(zai)小鼠模型中，來自長(chang)期(qi)存(cun)(cun)活(huo)者(zhe)的糞便微生物群移植（FMT）減少了腫瘤(liu)(liu)大小，而來自短期(qi)存(cun)(cun)活(huo)者(zhe)的 FMT（STS）導致腫瘤(liu)(liu)增大和 CD4+ FOXP3+ T 細(xi)(xi)胞(bao)的增加。以往研究表(biao)明，一種免疫學上重(zhong)要的細(xi)(xi)菌代謝物—吲哚，可通過激活(huo)轉錄調節(jie)因子 AhR 來調控 T 細(xi)(xi)胞(bao)、樹突狀細(xi)(xi)胞(bao)和巨噬細(xi)(xi)胞(bao)的功能(neng)，從而抑(yi)制炎癥。巨噬細(xi)(xi)胞(bao)是(shi) PDAC 免疫浸潤的主要組成部分。而且 AhR 在(zai)(zai)髓(sui)系細(xi)(xi)胞(bao)中的表(biao)達更(geng)高，這提示著或許髓(sui)系細(xi)(xi)胞(bao)具(ju)有(you)對(dui) AhR 配體更(geng)高的敏感性。

本(ben)研究先對 PDAC 腫(zhong)瘤內巨(ju)噬細胞(bao)、組織內巨(ju)噬細胞(bao)進(jin)行(xing) bulk 轉錄(lu)組檢測(ce)(ce)。然后對腫(zhong)瘤移植(zhi) 14 天(tian)后的 PDAC AhR 缺失(shi)小鼠(shu)和 PDAC 正常小鼠(shu)的腫(zhong)瘤樣本(ben)進(jin)行(xing) scRNA-seq 測(ce)(ce)序（n=3）。同時還對腫(zhong)瘤小鼠(shu)的腸(chang)道內容物進(jin)行(xing) 16S 測(ce)(ce)序，對灌胃(wei)處(chu)理的 C57BL/6J 小鼠(shu)胃(wei)腸(chang)道進(jin)行(xing)靶(ba)向代謝組檢測(ce)(ce)。

作者通過 scRNA-seq 結合 16s 和靶向代(dai)謝(xie)組測序(xu)研究了(le) AhR 對 PDAC 中(zhong)腫(zhong)瘤相關(guan)巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao) (TAM) 功能(neng)的影(ying)響。TAMs 表現出高 AhR 活(huo)性，AhR 缺失的巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)表現出炎癥表型。髓系細(xi)胞(bao)中(zhong) Ahr 的缺失或 Ahr 的藥理學抑制(zhi)降低(di)了(le) PDAC 的生長，提高了(le)免疫(yi)(yi)檢(jian)查點阻(zu)斷(duan)的效果，增加了(le) IFNγ+CD8+ T 細(xi)胞(bao)的腫(zhong)瘤內(nei)頻(pin)率(lv)（圖(tu) 1）。研究者發現乳桿菌(jun)將膳食中(zhong)的色氨酸代(dai)謝(xie)為吲哚(duo)并激活(huo)巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao) AhR 活(huo)性。去除膳食色氨酸可降低(di) TAM 的 AhR 活(huo)性，促進腫(zhong)瘤內(nei) TNFα+IFNγ+CD8+ T 細(xi)胞(bao)的聚集；在膳食中(zhong)添加吲哚(duo)可以阻(zu)斷(duan)這(zhe)種作用。并且，在 PDAC 患者中(zhong)，高 AHR表達與快速疾病(bing)進展和死亡(wang)率(lv)以及免疫(yi)(yi)抑制(zhi) TAM 表型相關(guan)，這(zhe)表明(ming)該(gai)調(diao)節(jie)軸在人類疾病(bing)中(zhong)具(ju)有保守(shou)性。

圖 1：scRNA-seq 揭示巨噬(shi)細胞 AhR 重塑 PDAC 中(zhong)的轉(zhuan)錄過程

原文索(suo)引(yin)

Deng G, Zhou L, Wang B, et al. Targeting cathepsin B by cycloastragenol enhances antitumor immunity of CD8 T cells via inhibiting MHC-I degradation. J Immunother Cancer. 2022;10(10):e004874. doi:10.1136/jitc-2022-004874

近年來，癌癥免疫療(liao)(liao)法(fa)蓬勃發展，其(qi)中，嵌合(he)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)受(shou)體（ chimeric antigen receptor，CAR）T 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)療(liao)(liao)法(fa)是(shi)突破性(xing)技術之一。該方法(fa)在(zai)(zai)(zai)白血(xue)病和淋(lin)巴(ba)瘤(liu)(liu)(liu)的(de)(de)治(zhi)療(liao)(liao)上卓有成效。但在(zai)(zai)(zai)實體腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)中，CAR-T 治(zhi)療(liao)(liao)還面臨(lin)兩個(ge)關鍵挑戰：1）腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)本身存(cun)在(zai)(zai)(zai)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)異質性(xing)，即不(bu)是(shi)所(suo)有的(de)(de)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)都表達 CAR 靶向(xiang)的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)；2）在(zai)(zai)(zai)治(zhi)療(liao)(liao)過程中發生的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)丟失，即腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在(zai)(zai)(zai)受(shou)到(dao) CAR T 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)攻擊(ji)時，一些腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)反應(ying)是(shi)停止靶抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)的(de)(de)產生。本文(wen)作者之前(qian)發現，給小鼠注射 CAR-T 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)后不(bu)久后，繼續注射攜帶 CAR-T 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)靶向(xiang)的(de)(de)相同(tong)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)的(de)(de)疫苗直接在(zai)(zai)(zai)原(yuan)(yuan)生淋(lin)巴(ba)結微(wei)環境中重(zhong)新刺激(ji) CAR - T 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可以(yi)有助于(yu) CAR-T 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)攻擊(ji)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)，而且還有助于(yu)產生針(zhen)對其(qi)他(ta)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)的(de)(de)宿主 T 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，即發生抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)擴散效應(ying)（Antigen spreading，AS）。因此，本次研究(jiu)作者主要想進一步(bu)探(tan)究(jiu) AS的(de)(de)作用(yong)機制。

本(ben)研究對(dui)小鼠膠質(zhi)母(mu)細(xi)(xi)胞(bao)瘤模型分別(bie)進(jin)行 CD45.1+CAR-T和(he)CD45.1CAR-T+Vax（CAR-T+ 疫苗）治(zhi)(zhi)療(liao)，在治(zhi)(zhi)療(liao)后(hou)的第 7 天(tian)和(he)第14天(tian)分別(bie)取腫(zhong)瘤組織(zhi)解離為單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)懸液并(bing)分選CD45.2+ CD4 和(he) CD8 T 細(xi)(xi)胞(bao)進(jin)行單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄組和(he)免疫組庫測序。

作(zuo)者發現(xian)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)增強(qiang)(qiang) CAR-T 細(xi)胞會觸發內源(yuan)性(xing)免(mian)疫(yi)(yi)系統的(de)(de)(de)(de)(de)參(can)與，以規避抗原(yuan)(yuan)陰性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)腫瘤逃逸。因此(ci)，作(zuo)者使用(yong)這種 CAR-T 治療(liao)聯合疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)增強(qiang)(qiang)作(zuo)為模型，結合單(dan)細(xi)胞轉錄組(zu)測序及(ji)其他驗證(zheng)手(shou)段(duan)，來了(le)解(jie) AS 效(xiao)應(ying)在(zai) CAR-T 清除具有(you)抗原(yuan)(yuan)異(yi)質性(xing)實體瘤中的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)機制(zhi)。結果發現(xian)，疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)增強(qiang)(qiang)的(de)(de)(de)(de)(de) CAR-T 可以促進樹突狀細(xi)胞（DC）向腫瘤的(de)(de)(de)(de)(de)募集，增加DC 對腫瘤抗原(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)攝取，并誘導內源(yuan)性(xing)抗腫瘤 T 細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)(de)啟動。這一過(guo)程伴隨(sui)著 CAR-T 代(dai)謝向氧化磷酸化（OXPHOS）的(de)(de)(de)(de)(de)轉變，并嚴重依賴于(yu) CAR-T 衍生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de) IFN-γ（圖(tu)(tu) 1）。疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)增強(qiang)(qiang)的(de)(de)(de)(de)(de) CAR-T 誘導的(de)(de)(de)(de)(de)抗原(yuan)(yuan)擴散效(xiao)應(ying)（AS）可以有(you)效(xiao)應(ying)對實體瘤的(de)(de)(de)(de)(de)抗原(yuan)(yuan)丟失(shi)現(xian)象，增強(qiang)(qiang) CAR-T 表達(da) IFN-γ 的(de)(de)(de)(de)(de)能力可以進一步增強(qiang)(qiang)異(yi)質性(xing)腫瘤的(de)(de)(de)(de)(de)治療(liao)效(xiao)果。因此(ci)，CAR-T 細(xi)胞來源(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de) IFN-γ 在(zai)促進 AS 中起著關鍵作(zuo)用(yong)，這一組(zu)合療(liao)法有(you)望成為治療(liao)實體瘤的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)效(xiao)手(shou)段(duan)（圖(tu)(tu) 2）。

原文索引

Ma L, Hostetler A, Morgan DM, et al. Vaccine-boosted CAR T crosstalk with host immunity to reject tumors with antigen heterogeneity. Cell. 2023;186(15):3148-3165.e20. doi:10.1016/j.cell.2023.06.002

超(chao)過 2.8 億人患(huan)(huan)有(you)(you)慢性(xing) HBV 感(gan)染（Chronic HBV, CHB），并且處于發展為肝(gan)(gan)硬(ying)化、肝(gan)(gan)功能衰竭或肝(gan)(gan)細胞癌 (HCC) 的(de)高風險中，這導(dao)致每(mei)年超(chao)過 700000 人死亡。目前，臨(lin)床(chuang)上(shang)用(yong)于 CHB 治療(liao)的(de)藥物(wu)主要(yao)包(bao)括干擾(rao)素和核苷（酸(suan)）類似物(wu)（NAs），抗病(bing)毒(du)治療(liao)能夠(gou)有(you)(you)效抑制(zhi)病(bing)毒(du)復制(zhi)，但僅極(ji)少數患(huan)(huan)者可以實現“功能性(xing)治愈”，大(da)量 CHB 患(huan)(huan)者需(xu)長期乃至終身抗病(bing)毒(du)治療(liao)。受限于肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)樣本(ben)可及性(xing)及傳(chuan)統(tong)研(yan)究技術手段，既往 HBV 感(gan)染相關臨(lin)床(chuang)轉(zhuan)化研(yan)究大(da)多使(shi)用(yong)外(wai)周血樣本(ben)，但仍然缺乏使(shi)用(yong) scRNA-seq 對(dui) HBV 感(gan)染的(de)肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)原位免(mian)疫反應的(de)全面視圖。

乙肝感(gan)染不同階段(duan)患(huan)者(zhe)（包括免(mian)疫耐受期(qi)—IT，n=6；免(mian)疫活(huo)化期(qi)—IA，n=5；急(ji)性(xing)感(gan)染恢復期(qi)—AR，n=3；慢性(xing)感(gan)染治愈(yu)患(huan)者(zhe)—CR，n=3）和(he)健康肝移(yi)植供者(zhe)（HC，n=6）作(zuo)為(wei)對照(zhao)，取外周(zhou)血和(he)肝臟穿刺組(zu)織的 CD45+ 免(mian)疫細(xi)胞做單細(xi)胞轉錄組(zu)和(he)單細(xi)胞免(mian)疫組(zu)庫測序。

作(zuo)(zuo)者(zhe)通(tong)過單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉錄(lu)組(zu)測序構建易(yi)感(gan)患者(zhe)肝臟(zang)(zang)和(he)外周免(mian)疫圖譜（圖 1），并發現(xian)(xian)(xian)：1）耗(hao)竭(jie) CD8+ T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)（Tex）在(zai) IT、IA 和(he) AR 組(zu)肝臟(zang)(zang)中(zhong)增(zeng)(zeng)多，其中(zhong) IA 和(he) AR 的(de)(de)(de)增(zeng)(zeng)加幅(fu)度更大且呈現(xian)(xian)(xian)更顯著(zhu)的(de)(de)(de)耗(hao)竭(jie)相(xiang)關轉錄(lu)特征。IA 和(he) AR 患者(zhe)中(zhong)耗(hao)盡(jin)的(de)(de)(de) CD8+T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)來源不(bu)同，CD8+T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)肝臟(zang)(zang)和(he)血液之間的(de)(de)(de)轉移可(ke)能促進病毒清除，表(biao)明影響 CD8+T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)功(gong)(gong)能和(he)分化的(de)(de)(de)因素在(zai) HBV 感(gan)染中(zhong)的(de)(de)(de)重要作(zuo)(zuo)用；2）發現(xian)(xian)(xian) IT 和(he) IA 階(jie)段(duan)，Treg(CD4T_C09-CTLA4) 和(he) Tex(CD8T_C08-LAYN) 之間存(cun)在(zai)顯著(zhu)的(de)(de)(de)交(jiao)互作(zuo)(zuo)用；3）FCGR3A+ 巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)可(ke)能通(tong)過 HLA-I_LILRB 信號傳導在(zai)調節(jie)慢(man)性感(gan)染期T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)應答(da)中(zhong)起著(zhu)關鍵(jian)作(zuo)(zuo)用，Tex、Treg 和(he) FCGR3A+ 巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞群之間在(zai) IT 和(he) IA 期表(biao)現(xian)(xian)(xian)出(chu)強烈的(de)(de)(de)相(xiang)互作(zuo)(zuo)用；4）IA 和(he) AR 患者(zhe)的(de)(de)(de) T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)功(gong)(gong)能紊亂與患者(zhe)的(de)(de)(de)肝組(zu)織損(sun)傷程度密切相(xiang)關。

圖 1：肝(gan)臟和血液(ye)中免(mian)疫(yi)細胞的單(dan)細胞轉(zhuan)錄組圖譜

原(yuan)文索引(yin)

Zhang C, Li J, Cheng Y, et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrahepatic and peripheral immune characteristics related to disease phases in HBV-infected patients. Gut. 2023;72(1):153-167. doi:10.1136/gutjnl-2021-325915

甲狀腺(xian)(xian)(xian)相(xiang)關性眼(yan)病(bing)（TAO）是以眼(yan)球后及眶周組(zu)織(zhi)的(de)(de)(de)浸潤性病(bing)變為特征的(de)(de)(de)器官特異自身(shen)免疫(yi)性疾病(bing)，是甲狀腺(xian)(xian)(xian)疾病(bing)最(zui)常見的(de)(de)(de)甲狀腺(xian)(xian)(xian)外表(biao)現(xian)(xian)之一(yi)。TAO常表(biao)現(xian)(xian)為突眼(yan)、眼(yan)瞼退縮、復視(shi)等，嚴重者甚至會危(wei)及視(shi)力，導致(zhi)失明。TAO涉及的(de)(de)(de)主(zhu)要過程是眶周組(zu)織(zhi)中(zhong)的(de)(de)(de)炎癥、糖胺聚糖積(ji)累、脂肪生成和肌纖維(wei)形(xing)成。由于(yu)目前于(yu)對其發病(bing)機(ji)制知之甚少(shao)，TAO的(de)(de)(de)治(zhi)療(liao)仍然具(ju)有挑戰性，因此，深(shen)入解析TAO眼(yan)眶結締組(zu)織(zhi)的(de)(de)(de)免疫(yi)微環(huan)境，有望為進一(yi)步(bu)闡明TAO發病(bing)機(ji)制和找到(dao)潛在的(de)(de)(de)治(zhi)療(liao)靶點提供分(fen)子依據。

取10名接受(shou)眶(kuang)減(jian)壓手(shou)術(shu)的TAO患者與(yu)10名接受(shou)眼瞼整形術(shu)的正常對(dui)照的眼眶(kuang)結締組織進行單細(xi)胞轉錄測序。

作者通(tong)過對甲狀腺相關性眼(yan)病（TAO）患者和正常對照的(de)(de)(de)眼(yan)眶結締組織進(jin)行單細(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄組測序，構建了 TAO 眼(yan)眶結締組織的(de)(de)(de)單細(xi)胞(bao)圖(tu)(tu)譜(pu)（圖(tu)(tu) 1），發現高表達 RASD1 的(de)(de)(de)成脂(zhi)分(fen)化成纖維(wei)細(xi)胞(bao)高度參與脂(zhi)肪生成和炎(yan)癥(zheng)，ACKR1 + 內皮細(xi)胞(bao)有助于 TAO 中的(de)(de)(de)炎(yan)癥(zheng)細(xi)胞(bao)浸潤，脂(zhi)肪組織巨噬(shi)細(xi)胞(bao)參與 TAO 中的(de)(de)(de)脂(zhi)質代謝(xie)和炎(yan)癥(zheng)反應，同時終末分(fen)化CD8+CTL 細(xi)胞(bao)也是(shi)眼(yan)眶組織干擾素的(de)(de)(de)分(fen)泌來源之(zhi)一(yi)（圖(tu)(tu) 2）。該研究拓展了對 TAO 眼(yan)眶組織免疫微環境的(de)(de)(de)認識，為(wei)探索(suo) TAO 的(de)(de)(de)潛在治(zhi)療(liao)靶點提供了新的(de)(de)(de)思路。

原(yuan)文索引

Li Z, Wang M, Tan J, et al. Single-cell RNA sequencing depicts the local cell landscape in thyroid-associated ophthalmopathy. Cell Rep Med. 2022;3(8):100699. doi:10.1016/j.xcrm.2022.100699