2017-04-21
說到叢枝菌(jun)(jun)(jun)根(gen)真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)研(yan)究，派森諾(nuo)生物(wu)已積累(lei)了豐富(fu)的(de)(de)(de)項目(mu)經驗。在眾(zhong)多(duo)項目(mu)合(he)作(zuo)過程中，我們發現不(bu)同的(de)(de)(de)PCR擴增引(yin)物(wu)對叢枝菌(jun)(jun)(jun)根(gen)真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)群落的(de)(de)(de)測序結果(guo)有很大的(de)(de)(de)影響。小編今天(tian)要講解(jie)的(de)(de)(de)這(zhe)篇(pian)發表在微生態學老牌期刊《Environmental Microbiology》（最新影響因子5.932）上的(de)(de)(de)論文，就對叢枝菌(jun)(jun)(jun)根(gen)真(zhen)(zhen)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)兩對不(bu)同引(yin)物(wu)的(de)(de)(de)擴增測序效(xiao)果(guo)進行了全方位的(de)(de)(de)比較和評估(gu)。
研(yan)究背(bei)景(jing)
真菌是土壤微生物中重要的組成部分，有些作為重要的環境物質降解代謝菌，有些則是病原體，當然也少不了植物菌根共生微生物，而其中叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）就是非常重要的一類微生物。AMF菌能與宿主植物互利共生，并為宿主提供氮、磷、硫源和水分，保護宿主免受病原體的侵害；作為回饋，宿主植物則將光合作用的產物以碳源的形式輸送給AMF菌。除此之外，AMF菌的多樣性是宿主植物多樣性的決定性因素之一。從2001年起，分類學上已將叢枝菌根真菌歸屬到Glomeromycota門下，其中包含Glomeromycetes綱以及Glomerales、Diversisporales、Archaeosporales和Paraglomerales目。鑒于AMF菌(jun)對宿(su)主植物和(he)土壤肥力的重要作用，運用高通量測(ce)序技術對AMF菌(jun)的多樣性組成(cheng)譜進(jin)行研究也(ye)已越來越流(liu)行。
研究目的
本文旨(zhi)在(zai)通(tong)過高(gao)通(tong)量測序的(de)(de)方(fang)法探究地中海生態系(xi)統中AMF菌的(de)(de)多樣性組成，并(bing)評估不同(tong)引物對于AMF群落多樣性組成譜測序結(jie)果的(de)(de)影(ying)響。
研究(jiu)方法
測(ce)序(xu)技(ji)術：454 GS-FLX焦磷酸高通(tong)量測(ce)序(xu)平臺
測序模式：AMF微(wei)生物(wu)組(zu)18S rRNA測序
實驗(yan)對象(xiang)：取自5個不同(tong)地點的25份土壤(rang)樣本
實驗設(she)計：意大(da)利(li)撒丁島(dao)（地中海區域）北邊的(de)丘陵主要富含五(wu)種土壤(rang)，分(fen)別(bie)為TV、CV、MM、PA、CO，每種土壤(rang)取5份(fen)土壤(rang)樣品(pin)，分(fen)別(bie)用(yong)兩(liang)對(dui)引(yin)物（AMV4.5NF/AMDGR和NS31/AMmix）進(jin)(jin)行(xing)擴增，得到50個擴增產(chan)物，對(dui)每種土壤(rang)的(de)五(wu)份(fen)樣品(pin)擴增產(chan)物進(jin)(jin)行(xing)混樣，用(yong)最終得到的(de)10個混合樣本進(jin)(jin)行(xing)高通量測序。
研究(jiu)結果
通過對(dui)10個(ge)土(tu)壤(rang)樣本進行高(gao)通量測(ce)序(xu)(xu)，共(gong)獲得(de)10924條(tiao)序(xu)(xu)列(lie)，每樣本平均獲得(de)1092條(tiao)高(gao)質(zhi)量序(xu)(xu)列(lie)。其中引物(wu)(wu)AMV4.5NF/AMDGR擴(kuo)增片段(duan)測(ce)序(xu)(xu)獲得(de)6799條(tiao)序(xu)(xu)列(lie)，而(er)引物(wu)(wu)NS31/AMmix擴(kuo)增片段(duan)測(ce)序(xu)(xu)獲得(de)4125條(tiao)序(xu)(xu)列(lie)。
在門水平，兩對(dui)引物所獲得(de)測序數(shu)據量（絕對(dui)豐度和(he)相對(dui)豐度）的比較。由圖中(zhong)(zhong)數(shu)據可知，引物AMV4.5NF/AMDGR擴增(zeng)片(pian)段測序結果中(zhong)(zhong)所包含的Glomeromycota門絕對(dui)序列量和(he)相對(dui)豐(feng)富都(dou)顯著大于引物NS31/AMmix擴(kuo)增片段測序獲得Glomeromycota門的數據量(liang)。
兩(liang)種不(bu)同引物(wu)測序所獲得的五種不(bu)同土壤樣品中，含有的Glomeromycota門數(shu)(shu)據量，引(yin)物(wu)AMV4.5NF/AMDGR所(suo)獲(huo)得的數(shu)(shu)據量都明(ming)顯高于另(ling)一對應物(wu)，并且在PA土壤(rang)中兩對引(yin)物(wu)所(suo)獲(huo)得的數(shu)(shu)據量都是(shi)最多的，而在CO土壤(rang)中則(ze)是(shi)最少(shao)的。
分別在相似度為80%、85%、95%、97%的條件下，對AMF菌測序所得序列劃分OTU，并繪制稀疏曲線。由圖可知，97%的閾值下劃分所得OTU數最多，但兩對引物在相同的閾值條件下，劃分所得OTU數差別很大；而通過ACE和Chao1指數預估的群落中OTU總數顯著多于97%閾值下劃分所得OTU數。
由OTU的豐度(du)等級曲線可知，在97%的相似度(du)下，序列(lie)都集中(zhong)于少數高豐度(du)OTU中(zhong)。
將測序所得(de)Glomeromycota門中4個目的測序序列數和97%閾值下劃分所(suo)得(de)(de)OTU數進行比較分析，由(you)餅(bing)圖可知，雖(sui)然兩對引物測序所(suo)得(de)(de)總(zong)數據量不同，但是其中所(suo)含Glomeromycota門(men)中4個目的(de)相(xiang)對豐度(du)是(shi)較為(wei)一(yi)致的(de)；由(you)OTU和數據量的(de)絕對豐度(du)和相(xiang)對豐度(du)柱狀(zhuang)圖(tu)可知(zhi)，不同土壤樣品(pin)中所含OTU數和測序序列數的(de)分布也(ye)是(shi)一(yi)致的(de)。
OTU維恩圖分析顯示，引物AMV4.5NF/AMDGR測序結果中，有11個OTU存在于五種不同土壤中，其中9個屬于Glomerales目，2個屬于Diversisporales目；引物NS31/AMmix測序結果中，五種土壤只共有1個OTU屬于Glomerales目；對五種土壤（引物AMV4.5NF/AMDGR）測序結果進行Jaccard相似指數分析，由表可知，土壤TV和PA、TV和CV之間AMF菌群組成結構的相似性最高。
總(zong)結
本研(yan)(yan)(yan)究(jiu)對(dui)(dui)意大(da)利撒(sa)丁(ding)島（地中海區域）北邊的(de)丘陵中主要(yao)富含的(de)五種土壤(rang)進行高通(tong)量測序(xu)(xu)，從而研(yan)(yan)(yan)究(jiu)AMF菌(jun)群的(de)多樣性組成譜(pu)。本研(yan)(yan)(yan)究(jiu)的(de)一個顯著特點在于，使用了兩對(dui)(dui)不同的(de)引物對(dui)(dui)土壤(rang)樣品進行擴(kuo)增(zeng)測序(xu)(xu)，而對(dui)(dui)兩對(dui)(dui)引物的(de)測序(xu)(xu)結果進行分析對(dui)(dui)比可知(zhi)，引物AMV4.5NF/AMDGR更(geng)適用于AMF菌(jun)的(de)高通(tong)量測序(xu)(xu)，為關注AMF菌(jun)多樣性組成的(de)眾多研(yan)(yan)(yan)究(jiu)人(ren)員提供了更(geng)加科學靠(kao)譜(pu)的(de)引物選擇(ze)依據！
文末福利(li)
值得一提的是(shi)，上述文獻中的兩對引物的擴增片(pian)段長(chang)度都(dou)在200~300 bp之間(jian)，都(dou)可(ke)以用Illumina超(chao)高(gao)通(tong)量的測序技(ji)術進行測序分析哦(e)！
另外，除(chu)了引物(wu)選擇，AMF菌(jun)群的(de)測序分析(xi)還有一個(ge)關(guan)鍵點(dian)，那就是使用MaarjAM（）數據(ju)庫(ku)進(jin)行物(wu)種(zhong)注釋！派(pai)森(sen)諾生物(wu)已(yi)將MaarjAM數據(ju)庫(ku)整合(he)于AMF菌(jun)群的(de)多樣性組成譜標準分析(xi)流程(cheng)，歡迎(ying)各位新老客戶來嘗試(shi)哦！
文章索(suo)引：
Lumini, E., Orgiazzi, A., Borriello, R., Bonfante, P. & Bianciotto, V.Disclosing arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land-use gradient using a pyrosequencing approach. Environ. Microbiol.12,165–2179 (2010).
點擊鏈(lian)接，閱(yue)讀原文：
