首先，作者(zhe)開(kai)發了一(yi)(yi)種利用點(dian)擊化(hua)學(xue)（AGTuC）的(de)全基(ji)(ji)因組轉(zhuan)錄組測序方(fang)(fang)(fang)法，是一(yi)(yi)種基(ji)(ji)于細胞(bao)群的(de)新(xin)生RNA測序方(fang)(fang)(fang)法，通過(guo)3′-(O-propargyl)-NTPs選(xuan)擇(ze)性(xing)標記(ji)新(xin)生RNA，偶聯(lian)5′端帶有AzScBc基(ji)(ji)團的(de)DNA PCR handle，逆轉(zhuan)錄RNA-DNA偶聯(lian)物并(bing)制(zhi)(zhi)備NGS文(wen)庫(ku)(ku)。為(wei)了能夠將該方(fang)(fang)(fang)法更(geng)(geng)好的(de)應用于單(dan)細胞(bao)測序，作者(zhe)進一(yi)(yi)步優(you)化(hua)AGTuC實驗條件(jian)，在標記(ji)過(guo)程中不會(hui)破壞核膜完整(zheng)性(xing)，稱為(wei)完整(zheng)核AGTuC（inAGTuC）。作者(zhe)利用inAGTuC測試了不同細胞(bao)核投入(ru)量(liang)下捕(bu)獲(huo)新(xin)生RNA的(de)效(xiao)率并(bing)與PRO-seq進行(xing)相關性(xing)比較，結(jie)果發現 AGTuC 和 inAGTuC具(ju)有更(geng)(geng)高(gao)的(de)效(xiao)率、更(geng)(geng)低(di)的(de)成本(ben)、更(geng)(geng)短(duan)的(de)文(wen)庫(ku)(ku)制(zhi)(zhi)備時間和更(geng)(geng)低(di)的(de)樣(yang)品(pin)起始量(liang)，是現有方(fang)(fang)(fang)法（PRO-seq）的(de)可行(xing)替代方(fang)(fang)(fang)案，同時為(wei)單(dan)細胞(bao)新(xin)生 RNA 測序奠定了基(ji)(ji)礎。

在(zai)inAGTuC的(de)基礎上，作者(zhe)開發了新的(de)化(hua)學(xue)物(wu)(wu)質(zhi)應用于單細(xi)(xi)胞新生RNA測(ce)序(xu)(xu)(xu)，將(jiang)其命名為scGRO-seq。首(shou)先分(fen)離(li)細(xi)(xi)胞核，加(jia)入3′-(O-propargyl)-nucleotides進(jin)(jin)行(xing)核run-on反應，將(jiang)附有(you)3′標(biao)記(ji)的(de)新生RNA完整細(xi)(xi)胞核通過(guo)流式分(fen)選至含有(you)尿素的(de)96孔板中（尿素可以(yi)裂解核膜并使 RNA 聚(ju)合(he)(he)酶(mei)變性并釋(shi)放標(biao)記(ji)的(de)新生 RNA），將(jiang)帶有(you)5′-AzScBc基團的(de)DNA接頭（包括位于5'-AzScBc 、10-12bp單細(xi)(xi)胞barcode序(xu)(xu)(xu)列、4-6bp UMI序(xu)(xu)(xu)列和(he) PCR handle）和(he)CuAAC MIX加(jia)入孔板中，在(zai)CuAAC的(de)作用下，炔丙(bing)基標(biao)記(ji)的(de)新生RNA與每個(ge)孔中唯(wei)一的(de)5′-AzScBc DNA連接形(xing)成(cheng)RNA-DNA偶(ou)聯物(wu)(wu)，將(jiang)孔板中RNA合(he)(he)并，加(jia)入TSO序(xu)(xu)(xu)列通過(guo)M-MuLV逆(ni)轉(zhuan)錄酶(mei)進(jin)(jin)行(xing)反轉(zhuan)錄，結(jie)束后(hou)通過(guo)Cas9去除空接頭，最后(hou)進(jin)(jin)行(xing)擴增和(he)測(ce)序(xu)(xu)(xu)。

圖1 scGRO-seq流程圖與(yu)驗證

scGRO-seq直接測定(ding)轉錄(lu)爆發動力學(xue)

與傳統熒光原位雜(za)交檢測轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)動(dong)力學的(de)方法不同，scGRO-seq能(neng)夠(gou)以單核苷酸分(fen)辨率(lv)檢測全基因(yin)組正(zheng)在轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)的(de)RNA聚(ju)(ju)合(he)(he)酶，能(neng)夠(gou)觀(guan)察到(dao)RNA聚(ju)(ju)合(he)(he)酶在基因(yin)上(shang)的(de)分(fen)布，反映了轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)的(de)動(dong)態過程(cheng)（圖(tu)2a）。為了驗證scGRO-seq能(neng)夠(gou)揭示(shi)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)爆(bao)發(fa)的(de)過程(cheng)，作(zuo)(zuo)者(zhe)設計了一個無偏(pian)倚的(de)模型(xing)，量化轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)RNA聚(ju)(ju)合(he)(he)酶的(de)發(fa)生(sheng)頻(pin)率(lv)，結(jie)果發(fa)現(xian)(xian)(xian)，在真實數據(ju)中(zhong)出(chu)現(xian)(xian)(xian)更高(gao)的(de)多聚(ju)(ju)體，表(biao)示(shi)多個RNA聚(ju)(ju)合(he)(he)酶同時轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)（圖(tu)2b），同時分(fen)析了多聚(ju)(ju)體之間的(de)距離分(fen)布發(fa)現(xian)(xian)(xian)，真實數據(ju)中(zhong)多聚(ju)(ju)體具有(you)更緊(jin)密的(de)RNA聚(ju)(ju)合(he)(he)酶分(fen)布（圖(tu)2c），進一步說明了scGRO-seq能(neng)夠(gou)捕獲到(dao)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)爆(bao)發(fa)現(xian)(xian)(xian)象。作(zuo)(zuo)者(zhe)通過scGRO-seq數據(ju)直接(jie)測定了轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)爆(bao)發(fa)的(de)動(dong)力學參數（圖(tu)2d-e），比較發(fa)現(xian)(xian)(xian)scGRO-seq與內含子(zi) seqFISH所得爆(bao)發(fa)頻(pin)率(lv)數據(ju)具有(you)良好相關性(xing)（圖(tu)2f），同時發(fa)現(xian)(xian)(xian)核心啟動(dong)子(zi)元(yuan)件和轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)因(yin)子(zi)可(ke)以調節轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)爆(bao)發(fa)參數（圖(tu)2g-h）。

綜上(shang)所述，scGRO-seq能夠直接(jie)和全面地(di)觀(guan)察轉錄爆發，有助于在單(dan)細胞水平上(shang)研究(jiu)轉錄動力學。

圖2 scGRO-seq推斷(duan)轉錄動力(li)學

目前，用(yong)于(yu)確(que)定的(de)細(xi)(xi)胞周(zhou)(zhou)期(qi)(qi)(qi)狀態的(de)傳(chuan)統(tong)scRNA-seq方(fang)法存(cun)(cun)在(zai)一(yi)(yi)定局限(xian)性，首(shou)先是大多數scRNA-seq依(yi)賴于(yu)poly（A）尾進行捕(bu)獲測序，因(yin)(yin)此無法檢測到復(fu)制(zhi)依(yi)賴性組(zu)蛋白基因(yin)(yin)（在(zai)S期(qi)(qi)(qi)專門轉(zhuan)錄(lu)(lu)的(de)最佳細(xi)(xi)胞周(zhou)(zhou)期(qi)(qi)(qi)期(qi)(qi)(qi)特(te)異(yi)(yi)性基因(yin)(yin)，無poly（A）尾）；其(qi)次，這些(xie)基因(yin)(yin)高度(du)特(te)異(yi)(yi)表(biao)達(da)(da)于(yu)S期(qi)(qi)(qi)，在(zai)前期(qi)(qi)(qi)樣本制(zhi)備時(shi)可能(neng)存(cun)(cun)在(zai)一(yi)(yi)定滯(zhi)后性，最終導致難以及時(shi)檢測到特(te)異(yi)(yi)性基因(yin)(yin)表(biao)達(da)(da)。而scGRO-seq能(neng)夠解(jie)決(jue)傳(chuan)統(tong)scRNA-seq存(cun)(cun)在(zai)的(de)問題，作(zuo)者利用(yong)scGRO-seq對小(xiao)鼠(shu)胚胎(tai)干細(xi)(xi)胞進行實驗，結(jie)果發現，scGRO-seq檢測到組(zu)蛋白位點體中(zhong)復(fu)制(zhi)依(yi)賴性組(zu)蛋白基因(yin)(yin)的(de)活性轉(zhuan)錄(lu)(lu)，并且可對S 期(qi)(qi)(qi)細(xi)(xi)胞進行分類（圖3a），通過不同(tong)細(xi)(xi)胞周(zhou)(zhou)期(qi)(qi)(qi)期(qi)(qi)(qi)特(te)異(yi)(yi)性基因(yin)(yin)表(biao)達(da)(da)的(de)分層(ceng)聚類揭示單個細(xi)(xi)胞的(de)三個重(zhong)要簇，三個簇具有不同(tong)的(de)細(xi)(xi)胞比例代表(biao)細(xi)(xi)胞不同(tong)周(zhou)(zhou)期(qi)(qi)(qi)階段(duan)的(de)長度(du)（圖3b），不同(tong)細(xi)(xi)胞周(zhou)(zhou)期(qi)(qi)(qi)轉(zhuan)錄(lu)(lu)水(shui)平存(cun)(cun)在(zai)差(cha)異(yi)(yi)（圖3c）。對細(xi)(xi)胞周(zhou)(zhou)期(qi)(qi)(qi)階段(duan)差(cha)異(yi)(yi)表(biao)達(da)(da)基因(yin)(yin)的(de)分析(xi)發現，細(xi)(xi)胞在(zai)DNA復(fu)制(zhi)過程中(zhong)雖然轉(zhuan)錄(lu)(lu)水(shui)平降低，但會持續(xu)進行，不同(tong)基因(yin)(yin)存(cun)(cun)在(zai)不同(tong)轉(zhuan)錄(lu)(lu)循環模式（圖3d）。

綜上所述，scGRO-seq能夠揭示(shi)整個細胞周期的動(dong)態轉(zhuan)錄程序。

圖3 scGRO-seq推(tui)斷組蛋(dan)白基因的細胞周期(qi)

作(zuo)者(zhe)利(li)用(yong)scGRO-seq探究功能(neng)相(xiang)關(guan)(guan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)是否在(zai)穩態下進行共(gong)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)。通過(guo)可視化方法直觀地展示了兩個(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)在(zai)單(dan)細胞水(shui)平(ping)上的共(gong)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)關(guan)(guan)系，表(biao)明這兩個(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)可能(neng)在(zai)時間(jian)上或功能(neng)上有某種聯系，比如可能(neng)受(shou)到(dao)相(xiang)同(tong)的轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)因(yin)子(zi)調(diao)控(kong)(kong)，或者(zhe)參與(yu)相(xiang)同(tong)的生(sheng)物學過(guo)程(cheng)（圖4a）。作(zuo)者(zhe)對(dui)(dui)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)過(guo)程(cheng)中共(gong)表(biao)達的基(ji)(ji)(ji)因(yin)對(dui)(dui)進行分析發現(xian)了共(gong)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)對(dui)(dui)在(zai)細胞周期調(diao)控(kong)(kong)、RNA剪(jian)接、翻譯控(kong)(kong)制等生(sheng)物學過(guo)程(cheng)中富集（圖4b）。作(zuo)者(zhe)將(jiang)scGRO-seq獲(huo)得的共(gong)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)對(dui)(dui)與(yu)內含子(zi)seqFISH比較共(gong)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)相(xiang)關(guan)(guan)性，結果發現(xian)兩者(zhe)具(ju)有高(gao)度相(xiang)似的共(gong)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)譜（圖4c）。

綜上所述，具有(you)高通量優勢的scGRO-seq能夠直接檢(jian)測基(ji)因對(dui)或基(ji)因網絡之(zhi)間的轉錄協調性，是研究基(ji)因組功(gong)能的重要(yao)工(gong)具。

圖4 功能相關基(ji)因的協調轉錄

作(zuo)者利(li)用(yong)scGRO-seq探(tan)究基因(yin)(yin)和增(zeng)強(qiang)(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)之間的(de)(de)(de)時間協調性(xing)。作(zuo)者分(fen)析了基因(yin)(yin)前 10 kb 內(nei)的(de)(de)(de) scGRO-seq讀段以及增(zeng)強(qiang)(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)周(zhou)(zhou)圍(wei)向外轉錄(lu)(lu)的(de)(de)(de)每條(tiao)鏈上至少(shao) 3 kb 的(de)(de)(de)讀段，結果發現增(zeng)強(qiang)(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)-基因(yin)(yin)共(gong)轉錄(lu)(lu)主(zhu)要在(zai) 200 kb 內(nei)顯著富集(ji)（圖(tu)(tu)5a），同(tong)一條(tiao)染色體上的(de)(de)(de)功能(neng)相(xiang)關(guan)基因(yin)(yin)聚集(ji)在(zai)一起時，多(duo)個(ge)增(zeng)強(qiang)(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)與每個(ge)基因(yin)(yin)相(xiang)關(guan)，可能(neng)是細胞(bao)周(zhou)(zhou)期(qi)調控的(de)(de)(de)進(jin)一步(bu)作(zuo)用(yong)所(suo)導致(zhi)結果（圖(tu)(tu)5b）。為了驗證(zheng)增(zeng)強(qiang)(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)轉錄(lu)(lu)可能(neng)在(zai)其(qi)靶基因(yin)(yin)啟動(dong)子(zi)(zi)(zi)(zi)轉錄(lu)(lu)之前開(kai)(kai)始的(de)(de)(de)假設，作(zuo)者通(tong)過CRISPR干擾驗證(zheng)多(duo)個(ge)增(zeng)強(qiang)(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)bin與該基因(yin)(yin)之間存在(zai)相(xiang)關(guan)性(xing)（圖(tu)(tu)5c），同(tong)時發現相(xiang)關(guan)的(de)(de)(de)增(zeng)強(qiang)(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)bin通(tong)常(chang)比基因(yin)(yin)bin距(ju)離其(qi) TSS 更遠，這(zhe)意味(wei)著增(zeng)強(qiang)(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)轉錄(lu)(lu)可能(neng)在(zai)啟動(dong)子(zi)(zi)(zi)(zi)轉錄(lu)(lu)之前開(kai)(kai)始（圖(tu)(tu)5d）。

綜上所(suo)述，scGRO-seq初步驗證(zheng)了增強子轉(zhuan)錄可能在啟(qi)動子轉(zhuan)錄之前開始，但(dan)該時(shi)間模式對增強子-基因轉(zhuan)錄調控的影響需(xu)進(jin)一步深入探究。

圖5 基因與增強子之間的時(shi)間協調

綜上(shang)所述(shu)，scGRO-seq可(ke)以(yi)不依賴(lai)于Poly（A）尾(wei)檢測新生(sheng)RNA，通(tong)(tong)過CuAAC可(ke)以(yi)捕(bu)獲約10%的(de)新生(sheng)RNA，作者(zhe)通(tong)(tong)過點(dian)擊化(hua)學取代了(le)多輪(lun)新生(sheng)的(de)RNA純化(hua)和核(he)酸連接，優化(hua)了(le)實驗步驟(zou)，增加高通(tong)(tong)量(liang)液滴封裝捕(bu)獲效率，擴(kuo)展了(le)scGRO-seq的(de)適(shi)用性。

scGRO-seq本質(zhi)上是多模(mo)態的(de)(de)，是一個可以(yi)深入詳細地理解轉(zhuan)錄(lu)調控的(de)(de)工具，它可以(yi)在天然環境(jing)中評估共轉(zhuan)錄(lu)和(he)預測(ce)增強子-基(ji)因(yin)調控網絡，文中作(zuo)者(zhe)已(yi)驗(yan)證scGRO-seq可以(yi)確(que)定表(biao)達(da)基(ji)因(yin)的(de)(de)突(tu)發大小和(he)頻率、細胞周(zhou)期階段的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)動力(li)學以(yi)及全基(ji)因(yin)組(zu)基(ji)因(yin)-基(ji)因(yin)和(he)增強子-基(ji)因(yin)共轉(zhuan)錄(lu)檢測(ce)等(deng)功能。

但(dan)目前的(de)(de)(de)scGRO-seq仍(reng)具有一定局(ju)限(xian)(xian)性。通(tong)過低sarkosyl濃(nong)度實(shi)現(xian)的(de)(de)(de)核完整性的(de)(de)(de)保(bao)持未能(neng)促(cu)進暫停復合物中(zhong)RNA聚合酶的(de)(de)(de)運行，從而限(xian)(xian)制(zhi)了(le)啟動(dong)子(zi)-近(jin)端暫停聚合酶的(de)(de)(de)檢測。在(zai)讀取深(shen)度和(he)細胞(bao)數量方(fang)面限(xian)(xian)制(zhi)了(le)對(dui)(dui)基(ji)因-基(ji)因和(he)增(zeng)強子(zi)-基(ji)因對(dui)(dui)的(de)(de)(de)爆發動(dong)力(li)學和(he)共轉錄的(de)(de)(de)分析(xi)。但(dan)盡管存在(zai)這些局(ju)限(xian)(xian)性，scGRO-seq的(de)(de)(de)適(shi)應性和(he)效率為研究(jiu)不同生物學背景下的(de)(de)(de)轉錄動(dong)力(li)學和(he)調控機制(zhi)提供(gong)了(le)新的(de)(de)(de)途徑(jing)，豐富了(le)對(dui)(dui)基(ji)因表(biao)達調控及其在(zai)生理和(he)病理條件(jian)下的(de)(de)(de)影響(xiang)的(de)(de)(de)理解(jie)。