2018-01-04
文獻簡介
靈(ling)芝是(shi)一(yi)種(zhong)屬于靈(ling)芝科的(de)白腐真菌，是(shi)多孢菌屬。靈(ling)芝作為中(zhong)藥的(de)使(shi)用而(er)聞名古今，在(zai)中(zhong)國(guo)、韓國(guo)、日本都有廣泛的(de)種(zhong)植(zhi)。微(wei)生(sheng)物直接暴露(lu)于各類環境(jing)中(zhong)產生(sheng)對(dui)(dui)環境(jing)的(de)應激反應是(shi)不(bu)可避免的(de)。尤其是(shi)熱脅迫常被(bei)報道影響微(wei)生(sheng)物的(de)生(sheng)理過程和生(sheng)長。近年來(lai)，全球溫室(shi)效應引起全球變(bian)暖現(xian)象對(dui)(dui)靈(ling)芝的(de)生(sheng)長和發育造成了負面影響。
據(ju)研究，一氧(yang)化(hua)氮(dan)(dan)增強(qiang)真(zhen)菌(jun)耐(nai)熱(re)(re)性起著重要的(de)作用。本文采用了RNA-seq技術來生成大范圍的(de)轉錄組(zu)數據(ju)，將(jiang)靈芝(zhi)的(de)菌(jun)絲(si)體暴露(lu)在外界不同溫度下，做熱(re)(re)脅迫實驗。結果表明(ming)：熱(re)(re)休克蛋(dan)白(bai)(bai)（HSPs）、應激誘(you)導蛋(dan)白(bai)(bai)以(yi)及在氨(an)基(ji)(ji)酸氧(yang)化(hua)酶(mei)活(huo)性和(he)氧(yang)化(hua)還(huan)原酶(mei)活(huo)性中所含的(de)非(fei)生物質，均可在靈芝(zhi)菌(jun)絲(si)中得到(dao)明(ming)顯的(de)調節。在增強(qiang)靈芝(zhi)對(dui)高溫的(de)耐(nai)受中，有(you)明(ming)顯的(de)可調節HSP、單氧(yang)酶(mei)、酒精脫(tuo)氫酶(mei)和(he)結合域內包含的(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質的(de)作用。這些結果證明(ming)了對(dui)靈芝(zhi)轉錄組(zu)測序(xu)的(de)意義，以(yi)及在基(ji)(ji)因表達水平(ping)上一氧(yang)化(hua)氮(dan)(dan)提高對(dui)真(zhen)菌(jun)的(de)耐(nai)熱(re)(re)力的(de)機制。
實驗材料：G. oregonenseSLZ72由中美科研(yan)者在(zai)中國西南(nan)地(di)區培育(yu)，本文做4組(zu)(zu)(zu)實(shi)驗(yan)，對照組(zu)(zu)(zu)28℃，高溫組(zu)(zu)(zu)32 ℃，高溫組(zu)(zu)(zu)32 ℃和不同濃度SNP，高溫組(zu)(zu)(zu)32 ℃和一氧化氮抑制劑。
平臺：Illumina HiSeq? 2000
委托單位：上海派森諾生物科技(ji)股份有限公司
研究結果
1、SNP對鮮菌(jun)絲(si)生物量的影響
圖1 不同度對靈芝的鮮菌(jun)絲生(sheng)物量（g）的影響
由圖1可知，在(zai)不同溫(wen)度對靈芝(zhi)的鮮菌絲生物量(liang)（g）的影響(xiang)。溫(wen)度在(zai)28℃時產(chan)量(liang)可達到33.04±1.29g，而溫(wen)度在(zai)24℃和34℃都不是促進鮮菌絲生物量(liang)的最佳溫(wen)度。
2、對(dui)靈芝(zhi)的轉錄組測序(xu)并進行從頭組裝
從圖(tu)2可知，在熱脅迫(po)(po)反應(ying)(ying)中，不同濃度的(de)(de)(de)(de)SNP對(dui)(dui)靈(ling)(ling)芝鮮菌(jun)(jun)(jun)絲(si)生物量的(de)(de)(de)(de)影響進行了(le)研究。共(gong)做了(le)7個(ge)實(shi)驗組(zu)(zu)(zu)，第一組(zu)(zu)(zu)對(dui)(dui)照組(zu)(zu)(zu)為(wei)(wei)(wei)(wei)28℃時靈(ling)(ling)芝菌(jun)(jun)(jun)絲(si)，第二組(zu)(zu)(zu)為(wei)(wei)(wei)(wei)32℃時靈(ling)(ling)芝菌(jun)(jun)(jun)絲(si)的(de)(de)(de)(de)脅迫(po)(po)反應(ying)(ying)，第三組(zu)(zu)(zu)為(wei)(wei)(wei)(wei)32℃、SNP的(de)(de)(de)(de)濃度為(wei)(wei)(wei)(wei)50μM時靈(ling)(ling)芝菌(jun)(jun)(jun)絲(si)的(de)(de)(de)(de)脅迫(po)(po)反應(ying)(ying)，第四組(zu)(zu)(zu)為(wei)(wei)(wei)(wei)32℃、SNP的(de)(de)(de)(de)濃度為(wei)(wei)(wei)(wei)100μM時靈(ling)(ling)芝菌(jun)(jun)(jun)絲(si)的(de)(de)(de)(de)脅迫(po)(po)反應(ying)(ying)，第五組(zu)(zu)(zu)為(wei)(wei)(wei)(wei)32℃、SNP的(de)(de)(de)(de)濃度為(wei)(wei)(wei)(wei)200μM時靈(ling)(ling)芝菌(jun)(jun)(jun)絲(si)的(de)(de)(de)(de)脅迫(po)(po)反應(ying)(ying)，第六組(zu)(zu)(zu)為(wei)(wei)(wei)(wei)32℃、SNP的(de)(de)(de)(de)濃度為(wei)(wei)(wei)(wei)300μM時靈(ling)(ling)芝菌(jun)(jun)(jun)絲(si)的(de)(de)(de)(de)脅迫(po)(po)反應(ying)(ying)，第七組(zu)(zu)(zu)為(wei)(wei)(wei)(wei)32℃、SNP的(de)(de)(de)(de)濃度為(wei)(wei)(wei)(wei)150μM的(de)(de)(de)(de)Fe(CN)6不釋放一氧化氮時靈(ling)(ling)芝菌(jun)(jun)(jun)絲(si)的(de)(de)(de)(de)脅迫(po)(po)反應(ying)(ying)。當靈(ling)(ling)芝菌(jun)(jun)(jun)絲(si)在32℃、SNP的(de)(de)(de)(de)濃度為(wei)(wei)(wei)(wei)100μM時鮮菌(jun)(jun)(jun)絲(si)生物量最高達32.75±2.13g。
圖(tu)2 SNP對靈芝鮮菌絲生(sheng)物量熱應激反應的影響
3、靈芝菌絲的功能分(fen)類及(ji)特(te)征
由圖3通(tong)過(guo)GO程序對基因進行功(gong)能(neng)分類可知，在生物功(gong)能(neng)中(zhong)新陳(chen)代謝功(gong)能(neng)和(he)(he)細(xi)胞功(gong)能(neng)所(suo)(suo)占比例最(zui)(zui)高，非別(bie)是10.31%和(he)(he)10.22%。在細(xi)胞組(zu)成(cheng)(cheng)功(gong)能(neng)中(zhong)，細(xi)胞及細(xi)胞組(zu)成(cheng)(cheng)部分所(suo)(suo)占比例最(zui)(zui)多，分別(bie)是8048%和(he)(he)8044%。在分子(zi)功(gong)能(neng)中(zhong)，催化(hua)活性功(gong)能(neng)和(he)(he)結合功(gong)能(neng)所(suo)(suo)占比例最(zui)(zui)高，非別(bie)是10.96%和(he)(he)8.84%。
圖3 靈芝轉錄組(zu)的(de)GO分(fen)類(lei)圖
為了進一步闡(chan)明靈(ling)芝(zhi)菌(jun)絲的(de)(de)生物(wu)學功能和基因相互作用，所有(you)58550個(ge)(ge)帶注(zhu)釋的(de)(de)unigenes被映射到(dao)KEGG數(shu)(shu)據(ju)庫中(zhong)的(de)(de)生物(wu)通(tong)(tong)路中(zhong)。由圖(tu)(tu)4可知，KEGG分類的(de)(de)直(zhi)方圖(tu)(tu)。縱軸上的(de)(de)字母代表不同的(de)(de)KEGG類別(bie)，費別(bie)為新陳代謝(xie)(xie)(xie)、遺傳信(xin)息處理(li)、環境信(xin)息處理(li)、細(xi)胞過程和組織(zhi)系(xi)統。大約(yue)2870個(ge)(ge)帶注(zhu)釋的(de)(de)unigenes在(zai)(zai)KEGG數(shu)(shu)據(ju)庫中(zhong)與31個(ge)(ge)KEGG通(tong)(tong)路有(you)顯著的(de)(de)匹配(pei)。1189個(ge)(ge)unigenes在(zai)(zai)新成(cheng)代謝(xie)(xie)(xie)通(tong)(tong)路中(zhong)，192個(ge)(ge)unigenes在(zai)(zai)碳水(shui)化合物(wu)代謝(xie)(xie)(xie)通(tong)(tong)路中(zhong)，175個(ge)(ge)unigenes在(zai)(zai)氨基酸代謝(xie)(xie)(xie)通(tong)(tong)路中(zhong)等。KEGG通(tong)(tong)路注(zhu)釋提供了一種價值的(de)(de)資(zi)源，可以用于研究靈(ling)芝(zhi)菌(jun)絲在(zai)(zai)熱應激反應中(zhong)的(de)(de)特定過程、功能和途徑。
圖4 KEGG直方圖
4、熱脅迫后差異基因的表(biao)達(da)
該文研究了調控真菌耐受性的無誘導基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達(da)譜。由圖(tu)5可知，利用系統圖(tu)對不同樣品進行熱圖(tu)和聚(ju)類(lei)分(fen)析。從綠色(se)到紅(hong)色(se)，基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達(da)水平增加。每個(ge)(ge)unigene的表(biao)達(da)水平均使用RPKM算法計算。在CK和HT中表(biao)達(da)的56771個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)中，484個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)在CK和HT中有顯著差異，其(qi)中197個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)在HT中上(shang)調。其(qi)中HT的上(shang)調基(ji)因(yin)(yin)中，HSP基(ji)因(yin)(yin)占比例最大。
圖5 用完整連鎖法分(fen)析不同樣品間的熱圖和(he)聚類分(fen)析
綜上所述，以(yi)上結果證(zheng)明(ming)了靈芝菌絲在高(gao)溫脅(xie)迫條件下不利于生物量產生。而當(dang)生長(chang)環境(jing)(jing)中(zhong)含有(you)一(yi)氧(yang)(yang)化氮時，鮮(xian)菌絲的生長(chang)量增加，這一(yi)研究證(zheng)明(ming)了一(yi)氧(yang)(yang)化氮對靈芝鮮(xian)菌絲在熱脅(xie)迫環境(jing)(jing)中(zhong)有(you)抗性。
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