HiDEF-seq為了實現對單鏈(lian)(lian)事件的(de)(de)(de)(de)(de)(de)高精度(du)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)，其具體(ti)流程大致如圖1所示：首先(xian)對基因組DNA進(jin)(jin)行(xing)處理，利(li)用Hpy166II限制性酶對基因組DNA進(jin)(jin)行(xing)消化(hua)。將(jiang)DNA片段(duan)化(hua)至1-4 kb大小(xiao)。然后分(fen)別進(jin)(jin)行(xing)nick ligation（缺口(kou)連(lian)接(jie)(jie)），A-tailing（A尾修飾(shi)）和(he)(he)hairpin ligation（發夾結(jie)構連(lian)接(jie)(jie)），連(lian)接(jie)(jie)上發卡(ka)結(jie)構的(de)(de)(de)(de)(de)(de)PacBio測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)接(jie)(jie)頭。使用Pacific Biosciences (PacBio)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單分(fen)子長(chang)讀長(chang)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)儀進(jin)(jin)行(xing)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)。通過增加(jia)獨立測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)遍(bian)(bian)數(shu)來提(ti)高每(mei)(mei)條(tiao)鏈(lian)(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)共(gong)識序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)質量(liang)。由(you)于PacBio的(de)(de)(de)(de)(de)(de)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)酶讀長(chang)平均在100 kb左右，也就(jiu)是(shi)說一(yi)個(ge)(ge)(ge)4 kb的(de)(de)(de)(de)(de)(de)片段(duan)平均可(ke)(ke)以(yi)(yi)被測(ce)(ce)(ce)25遍(bian)(bian)，正(zheng)(zheng)(zheng)反(fan)(fan)兩條(tiao)鏈(lian)(lian)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)每(mei)(mei)一(yi)條(tiao)都(dou)可(ke)(ke)以(yi)(yi)被測(ce)(ce)(ce)到(dao)至少12次，然后將(jiang)每(mei)(mei)一(yi)條(tiao)鏈(lian)(lian)被反(fan)(fan)復(fu)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)拿到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)合(he)(he)并在一(yi)起分(fen)別合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)一(yi)個(ge)(ge)(ge)單鏈(lian)(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)共(gong)識序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)，這個(ge)(ge)(ge)過程中(zhong)每(mei)(mei)個(ge)(ge)(ge)位置的(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)都(dou)會被反(fan)(fan)復(fu)獨立測(ce)(ce)(ce)數(shu)十遍(bian)(bian)，合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)共(gong)識序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)候就(jiu)可(ke)(ke)以(yi)(yi)直(zhi)接(jie)(jie)將(jiang)幾(ji)乎所有的(de)(de)(de)(de)(de)(de)測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)錯(cuo)誤都(dou)排除(chu)掉，這樣(yang)就(jiu)可(ke)(ke)以(yi)(yi)拿到(dao)一(yi)個(ge)(ge)(ge)高準確度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)正(zheng)(zheng)(zheng)反(fan)(fan)鏈(lian)(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單鏈(lian)(lian)共(gong)識序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)，最后再(zai)(zai)根據正(zheng)(zheng)(zheng)反(fan)(fan)鏈(lian)(lian)互(hu)補配對的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原則再(zai)(zai)對正(zheng)(zheng)(zheng)反(fan)(fan)鏈(lian)(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)共(gong)識序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)進(jin)(jin)行(xing)矯(jiao)正(zheng)(zheng)(zheng)得到(dao)一(yi)個(ge)(ge)(ge)雙鏈(lian)(lian)突變的(de)(de)(de)(de)(de)(de)信息，就(jiu)可(ke)(ke)以(yi)(yi)同(tong)時(shi)拿到(dao)單鏈(lian)(lian)和(he)(he)雙鏈(lian)(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)突變信息和(he)(he)突變率。正(zheng)(zheng)(zheng)因為Duplex測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)和(he)(he)PacBio的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HiFi測(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)巧妙組合(he)(he)，使得HiDEF-seq成(cheng)(cheng)(cheng)為目前最準確的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單分(fen)子突變率檢(jian)測(ce)(ce)(ce)技術，單鏈(lian)(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)突變率降低到(dao)千(qian)萬(wan)分(fen)之一(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)水平，而雙鏈(lian)(lian)突變率更(geng)是(shi)低于萬(wan)億分(fen)之一(yi)。

作者對HiDEF-seq與NanoSeq這兩(liang)種(zhong)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)方(fang)(fang)法的比(bi)較(jiao)結(jie)(jie)果(guo)(guo)，主要目的是為了(le)評(ping)估這兩(liang)種(zhong)方(fang)(fang)法在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)不同類(lei)型(xing)的DNA變(bian)(bian)(bian)異時的表現(xian)差異，評(ping)估不同測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)技術(shu)的優勢和(he)(he)局限性，特別(bie)是在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)低(di)(di)頻(pin)變(bian)(bian)(bian)異或特定組(zu)織/細胞(bao)類(lei)型(xing)中(zhong)的變(bian)(bian)(bian)異時。比(bi)較(jiao)主要集中(zhong)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)兩(liang)個方(fang)(fang)面(mian)(mian)：雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA(dsDNA)突(tu)變(bian)(bian)(bian)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)和(he)(he)單鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA(ssDNA)事(shi)件(jian)（如錯(cuo)配和(he)(he)損(sun)傷）的檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA(dsDNA)突(tu)變(bian)(bian)(bian)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)方(fang)(fang)面(mian)(mian)，HiDEF-seq能夠(gou)(gou)達到(dao)(dao)非常高的保真度，低(di)(di)于(yu)每(mei)10億個堿基1個錯(cuo)誤(wu)（10-9），且能夠(gou)(gou)測(ce)(ce)(ce)(ce)量到(dao)(dao)預期的雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)(bian)特征以及(ji)隨(sui)著年齡(ling)增長線(xian)性增加的突(tu)變(bian)(bian)(bian)負(fu)擔。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)(bian)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)這一指(zhi)標上(shang)，NanoSeq與HiDEF-seq結(jie)(jie)果(guo)(guo)一致，表明兩(liang)種(zhong)技術(shu)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)此(ci)方(fang)(fang)面(mian)(mian)的性能相當。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)單鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA(ssDNA)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)方(fang)(fang)面(mian)(mian)，HiDEF-seq在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)單鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA事(shi)件(jian)時，平(ping)均負(fu)載比(bi)NanoSeq低(di)(di)18倍，考慮C>T調換時則低(di)(di)5倍。而在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)NanoSeq雖然在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)(bian)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)方(fang)(fang)面(mian)(mian)表現(xian)出色，但(dan)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)單鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA事(shi)件(jian)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)方(fang)(fang)面(mian)(mian)可能存在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)較(jiao)高的人工產(chan)物。這些結(jie)(jie)果(guo)(guo)表明，HiDEF-seq和(he)(he)NanoSeq在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)(bian)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)方(fang)(fang)面(mian)(mian)的表現(xian)相似，均能準確(que)(que)地檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)并量化雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)(bian)。但(dan)是，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)單鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)(bian)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)方(fang)(fang)面(mian)(mian)，HiDEF-seq相比(bi)于(yu)NanoSeq展現(xian)出更(geng)高的準確(que)(que)性，這使得HiDEF-seq成為目前檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)單鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA事(shi)件(jian)最準確(que)(que)的技術(shu)之(zhi)一。

圖1. HiDEF-seq概述(shu)

研(yan)究團隊通過HiDEF-seq技術對來(lai)自(zi)不同癌癥易感(gan)性綜(zong)合(he)(he)(he)征(zheng)患者的(de)(de)(de)樣本進行了(le)分析。結果顯(xian)示，與(yu)(yu)非癌癥易感(gan)性樣本相(xiang)比，某些(xie)綜(zong)合(he)(he)(he)征(zheng)樣本的(de)(de)(de)單(dan)(dan)鏈(lian)DNA損(sun)傷(shang)(shang)程度(du)(du)顯(xian)著更高(gao)。特別是POLE聚合(he)(he)(he)酶校(xiao)對相(xiang)關的(de)(de)(de)息肉綜(zong)合(he)(he)(he)征(zheng)（PPAP）和先天性錯(cuo)配修復缺(que)陷(xian)綜(zong)合(he)(he)(he)征(zheng)（CMMRD）樣本，單(dan)(dan)鏈(lian)DNA損(sun)傷(shang)(shang)的(de)(de)(de)程度(du)(du)顯(xian)著增加。此外，研(yan)究還(huan)發現了(le)與(yu)(yu)POLE相(xiang)關的(de)(de)(de)單(dan)(dan)鏈(lian)DNA錯(cuo)配特征(zheng)SBS10ss，并(bing)確認其(qi)與(yu)(yu)已(yi)知的(de)(de)(de)雙(shuang)鏈(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)特征(zheng)SBS10c高(gao)度(du)(du)相(xiang)似，這證實了(le)單(dan)(dan)鏈(lian)DNA錯(cuo)配可(ke)能是雙(shuang)鏈(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)的(de)(de)(de)起始(shi)事件。缺(que)乏錯(cuo)配修復和聚合(he)(he)(he)酶校(xiao)對的(de)(de)(de)高(gao)突(tu)變(bian)(bian)腫瘤(liu)(liu)樣本展(zhan)現了(le)獨特的(de)(de)(de)ssDNA損(sun)傷(shang)(shang)模式(shi)，這些(xie)模式(shi)與(yu)(yu)腫瘤(liu)(liu)中觀察到的(de)(de)(de)雙(shuang)鏈(lian)DNA突(tu)變(bian)(bian)譜具有較高(gao)的(de)(de)(de)相(xiang)似性。

圖2. 癌癥易感性綜(zong)合征的ssDNA呼(hu)叫(jiao)負擔和(he)模式

研究表明，在缺乏錯(cuo)配(pei)修復和聚(ju)合酶校正的高(gao)突變腫瘤中(zhong)(zhong)，單鏈DNA的錯(cuo)配(pei)模式明顯不同(tong)于僅缺乏聚(ju)合酶校正的樣(yang)本(ben)。這(zhe)些腫瘤樣(yang)本(ben)尤其表現出較(jiao)高(gao)的單鏈DNA C>T錯(cuo)配(pei)，這(zhe)些錯(cuo)配(pei)主要來源于胞嘧啶的脫氨(an)損傷(shang)，而不是(shi)(shi)聚(ju)合酶的錯(cuo)誤插(cha)入。此(ci)外，從這(zhe)些腫瘤樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)提取的單鏈DNA錯(cuo)配(pei)特(te)(te)征SBS14ss，與COSMIC數據庫中(zhong)(zhong)記錄的雙鏈DNA特(te)(te)征SBS14高(gao)度(du)相似，這(zhe)表明這(zhe)些單鏈突變可(ke)能是(shi)(shi)引發(fa)雙鏈DNA突變的初始步驟。

圖(tu)3. 在(zai)(zai)錯配修復和聚合酶校對方(fang)面都存在(zai)(zai)缺陷(xian)的高突變腫瘤(liu)

HiDEF-seq技術能(neng)夠以單(dan)分子精(jing)度檢測胞嘧(mi)啶(ding)脫(tuo)(tuo)氨(an)損(sun)傷，這(zhe)是(shi)一(yi)種常(chang)見的(de)(de)(de)DNA損(sun)傷形(xing)式，可導(dao)致(zhi)雙鏈DNA中的(de)(de)(de)C>T突變。研究中發現(xian)，健康個體的(de)(de)(de)血液DNA樣本(ben)中存在低水平(ping)的(de)(de)(de)單(dan)鏈DNA C>T突變，這(zhe)些突變可能(neng)是(shi)由于(yu)胞嘧(mi)啶(ding)的(de)(de)(de)自發脫(tuo)(tuo)氨(an)或實驗室處理(li)過程(cheng)(cheng)中的(de)(de)(de)熱誘(you)導(dao)造成(cheng)的(de)(de)(de)。此外，精(jing)子樣本(ben)中觀察(cha)到了更高的(de)(de)(de)胞嘧(mi)啶(ding)脫(tuo)(tuo)氨(an)損(sun)傷水平(ping)，這(zhe)可能(neng)與精(jing)子生(sheng)成(cheng)或處理(li)過程(cheng)(cheng)中的(de)(de)(de)特定(ding)條件(jian)有關。通過對(dui)動力(li)學數據(ju)的(de)(de)(de)分析(xi)，研究進一(yi)步確認了這(zhe)些損(sun)傷源(yuan)自胞嘧(mi)啶(ding)脫(tuo)(tuo)氨(an)。

圖4. 精子和熱(re)處理DNA的(de)ssDNA損傷(shang)特征

HiDEF-seq技術為揭示線粒(li)(li)(li)體基因(yin)(yin)組(zu)(zu)突變(bian)機制(zhi)提供(gong)了新(xin)的見解。研究(jiu)表明，線粒(li)(li)(li)體基因(yin)(yin)組(zu)(zu)的突變(bian)率(lv)顯著(zhu)高(gao)于核基因(yin)(yin)組(zu)(zu)，這些突變(bian)主要發(fa)(fa)生在(zai)DNA復(fu)制(zhi)過程(cheng)中(zhong)，可能與線粒(li)(li)(li)體DNA復(fu)制(zhi)時部分單(dan)鏈暴露有關。通過對(dui)肝臟和腎臟樣本(ben)的分析，研究(jiu)發(fa)(fa)現(xian)線粒(li)(li)(li)體DNA的雙(shuang)鏈突變(bian)負(fu)荷與年齡存在(zai)正相關，并且在(zai)線粒(li)(li)(li)體重(zhong)鏈上(shang)觀察到A>G和C>T突變(bian)的非(fei)對(dui)稱模式(shi)。這些結(jie)果進(jin)一(yi)步支持(chi)了線粒(li)(li)(li)體基因(yin)(yin)組(zu)(zu)在(zai)復(fu)制(zhi)期(qi)間發(fa)(fa)生突變(bian)的觀點。

圖5. 線粒(li)體基(ji)因組(zu)dsDNA和ssDNA的調用負(fu)荷和模式(shi)

HiDEF-seq技(ji)術(shu)的(de)應(ying)用不僅在(zai)技(ji)術(shu)層面上取得了(le)顯(xian)著進展，還(huan)在(zai)生物學上為探(tan)究DNA突變的(de)起源和(he)(he)(he)機制(zhi)提(ti)供(gong)了(le)新(xin)的(de)工具(ju)和(he)(he)(he)視角。該技(ji)術(shu)能夠詳細揭(jie)示單鏈DNA事件，實(shi)(shi)時監測DNA損傷(shang)、修復(fu)和(he)(he)(he)復(fu)制(zhi)過程的(de)動(dong)態(tai)，這(zhe)對(dui)于理解(jie)突變在(zai)癌癥(zheng)(zheng)(zheng)和(he)(he)(he)衰老等背景下(xia)的(de)產(chan)生至關重要。研究發現，不僅為癌癥(zheng)(zheng)(zheng)易感性綜(zong)合征中突變的(de)起源提(ti)供(gong)了(le)新(xin)的(de)線索，還(huan)為未(wei)來的(de)治療(liao)和(he)(he)(he)干預策略提(ti)供(gong)了(le)潛在(zai)的(de)靶(ba)點。此外，HiDEF-seq對(dui)線粒體基(ji)因組突變機制(zhi)的(de)新(xin)認識，也(ye)為相關疾病的(de)研究和(he)(he)(he)治療(liao)開辟了(le)新(xin)的(de)方向。隨著該技(ji)術(shu)的(de)不斷(duan)發展和(he)(he)(he)應(ying)用，有望在(zai)癌癥(zheng)(zheng)(zheng)預防和(he)(he)(he)治療(liao)等領域實(shi)(shi)現更多突破。這(zhe)項技(ji)術(shu)具(ju)有廣闊的(de)應(ying)用前景，將極大推動(dong)我們(men)對(dui)DNA突變及其相關疾病機制(zhi)的(de)理解(jie)。