EGFR突變是非小細胞(bao)肺(fei)(fei)癌（NSCLC）最常見的(de)(de)突變類型。對EGFR-TKIs（酪氨(an)酸激酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑）治(zhi)療(liao)(liao)的(de)(de)耐(nai)藥(yao)性一致(zhi)被認為(wei)(wei)是EGFR突變型非小細胞(bao)肺(fei)(fei)癌（NSCLC）患者(zhe)治(zhi)療(liao)(liao)失敗(bai)和(he)癌癥復發的(de)(de)主要原因。2024年8月15日(ri)，中國科學院(yuan)謝華、丁健、周虎及(ji)趙(zhao)桂(gui)龍共(gong)同通訊在(zai)Signal Transduction and Targeted Therapy （IF40.8）發表題為(wei)(wei)“Branched-chain amino acid transaminase 1 confers EGFR-TKI resistance through epigenetic glycolytic activation”的(de)(de)研究論文，在(zai)本研究中作者(zhe)采用高通量(liang)蛋白質(zhi)組(zu)學分析(xi)來表征癌細胞(bao)獲得抗(kang)性后蛋白質(zhi)組(zu)的(de)(de)改變，旨在(zai)識別第三(san)代EGFR TKIs的(de)(de)新抗(kang)性機(ji)制(zhi)，并找到了治(zhi)療(liao)(liao)TKI耐(nai)藥(yao)NSCLC的(de)(de)治(zhi)療(liao)(liao)靶點以(yi)及(ji)新型的(de)(de)靶向抑(yi)制(zhi)劑。

一．BCAT1在EGFR TKI耐(nai)藥腫瘤中表達上調，并與(yu)肺(fei)腺癌的不良預后相關

作者首先(xian)構建了(le)(le)(le)腫(zhong)瘤耐(nai)藥(yao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)。將TKI敏感的(de)(de)(de)NCI-H1975（EGFRL858R/T790M）NSCLC親本(ben)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)劑量遞增暴露(lu)于ASK120067或奧西替尼中(zhong)(zhong)（分(fen)(fen)別用67R和AZDR表示第三代(dai)EGFR靶向(xiang)藥(yao)物），生成(cheng)EGFR TKI耐(nai)藥(yao)NSCLC細(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)，并使用集(ji)落形成(cheng)和細(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖試驗驗證了(le)(le)(le)耐(nai)藥(yao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)對EGFR TKI的(de)(de)(de)敏感性降(jiang)低。其次為了(le)(le)(le)找到與耐(nai)藥(yao)性相(xiang)關的(de)(de)(de)調(diao)(diao)控蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)，通過SILAC穩(wen)定同位素標記蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)質組(zu)學，比較(jiao)了(le)(le)(le)三種(zhong)(zhong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)變(bian)(bian)化（圖1a），發現耐(nai)藥(yao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)表達(da)模式相(xiang)似，兩種(zhong)(zhong)耐(nai)藥(yao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)存在(zai)(zai)563個重(zhong)(zhong)疊蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)（圖1b）。對重(zhong)(zhong)疊蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)進行(xing)功(gong)能富集(ji)分(fen)(fen)析顯(xian)示，代(dai)謝(xie)途徑存在(zai)(zai)顯(xian)著的(de)(de)(de)失(shi)調(diao)(diao)，其中(zhong)(zhong)參(can)與支鏈(lian)氨(an)基酸（BCAA）降(jiang)解的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)在(zai)(zai)耐(nai)藥(yao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)發生了(le)(le)(le)最顯(xian)著的(de)(de)(de)改(gai)變(bian)(bian)，這表明BCAA代(dai)謝(xie)可能參(can)與了(le)(le)(le)EGFR TKI介導的(de)(de)(de)耐(nai)藥(yao)。在(zai)(zai)所有參(can)與BCAAs降(jiang)解的(de)(de)(de)酶中(zhong)(zhong)（圖1d），支鏈(lian)氨(an)基酸轉氨(an)酶1（BCAT1）較(jiao)為顯(xian)著，隨后(hou)作者在(zai)(zai)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)和異種(zhong)(zhong)移(yi)植腫(zhong)瘤組(zu)織中(zhong)(zhong)測定了(le)(le)(le)BCAT1 mRNA和蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)水平表達(da)的(de)(de)(de)升高(gao)（圖1e，f）。

圖1  TKI耐(nai)藥(yao)肺癌(ai)中(zhong)BCAT1表達增強的發現和驗證

為(wei)了評估BCAT1在(zai)肺(fei)癌(ai)(ai)(ai)中的(de)(de)臨床相關性，對(dui)GEO數據(ju)庫中肺(fei)腺癌(ai)(ai)(ai)（LUAD）數據(ju)集進行分析，發(fa)(fa)現BCAT1在(zai)復發(fa)(fa)腫(zhong)瘤中的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達高(gao)(gao)于非復發(fa)(fa)組(zu)（圖(tu)(tu)2a），LUAD患(huan)者(zhe)的(de)(de)BCAT1表(biao)(biao)(biao)達與無(wu)復發(fa)(fa)生存(cun)期（RFS）時間呈(cheng)負相關（圖(tu)(tu)2b）。與TKI敏(min)感的(de)(de)患(huan)者(zhe)相比，TKI耐藥患(huan)者(zhe)的(de)(de)樣本(ben)中BCAT1表(biao)(biao)(biao)達升(sheng)高(gao)(gao)（圖(tu)(tu)2c）。作者(zhe)對(dui)臨床腫(zhong)瘤樣本(ben)采用免(mian)疫組(zu)化(hua)染色法檢測(ce)BCAT1的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達（圖(tu)(tu)2d），與癌(ai)(ai)(ai)旁非癌(ai)(ai)(ai)組(zu)織相比，肺(fei)癌(ai)(ai)(ai)腫(zhong)瘤中BCAT1的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達水平明顯升(sheng)高(gao)(gao)。這些發(fa)(fa)現強調了BCAT1在(zai)肺(fei)癌(ai)(ai)(ai)中的(de)(de)臨床相關性。

使用shRNA敲除支鏈氨(an)基(ji)酸轉氨(an)酶1（BCAT1）發現顯著抑(yi)制了67R和(he)(he)AZDR細(xi)(xi)胞(bao)的(de)集落形成（圖3a，b），使用BCAT1抑(yi)制劑gabapentin發現選擇(ze)性減少了耐藥(yao)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)形成（圖3c，d），BCAT1抑(yi)制劑的(de)藥(yao)理抑(yi)制作用可使67R和(he)(he)AZDR細(xi)(xi)胞(bao)分別對(dui)ASK120067和(he)(he)奧西替(ti)尼致敏（圖3f，g）。使用細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)(zhi)試(shi)驗(yan)觀察到(dao)類似(si)的(de)結(jie)果。與NCI-H1975細(xi)(xi)胞(bao)相比，gabapentin選擇(ze)性抑(yi)制67R和(he)(he)AZDR細(xi)(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖(zhi)(zhi)。這些結(jie)果表明，BCAT1是(shi)TKI耐藥(yao)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)存活和(he)(he)耐藥(yao)性所必需的(de)。

為了(le)(le)進一步(bu)確定BCAT1在小鼠模型中的(de)(de)功能(neng)作用(yong)，作者使用(yong)穩定表(biao)達shCtrl或shBCAT1的(de)(de)67R細(xi)(xi)胞(bao)(bao)建立了(le)(le)皮下(xia)異種(zhong)移植(zhi)模型。發現下(xia)調BCAT1顯著(zhu)削弱(ruo)了(le)(le)67R細(xi)(xi)胞(bao)(bao)形成(cheng)腫瘤的(de)(de)能(neng)力，導(dao)致腫瘤形成(cheng)率和(he)腫瘤重量均顯著(zhu)下(xia)降（圖3i、j和(he)補充圖4f）。這些發現證實了(le)(le)BCAT1在耐(nai)(nai)藥NSCLC細(xi)(xi)胞(bao)(bao)存活中的(de)(de)關鍵作用(yong)，以及它介(jie)導(dao)了(le)(le)對(dui)第三代(dai)EGFR TKIs的(de)(de)耐(nai)(nai)藥性。

圖3  BCAT1 維持(chi)細胞存活并(bing)賦予對第三(san)代(dai) EGFR TKI 的耐藥(yao)性

支(zhi)(zhi)鏈(lian)氨(an)基酸(suan)轉氨(an)酶(mei)1（BCAT1）是負責從支(zhi)(zhi)鏈(lian)氨(an)基酸(suan)（BCAAs）和(he)α-酮戊(wu)二酸(suan)（α-KG）可(ke)逆轉化為支(zhi)(zhi)鏈(lian)酮酸(suan)（BCKAs）和(he)谷氨(an)酸(suan)的(de)關(guan)鍵(jian)酶(mei)，接下(xia)來作者探索(suo)了(le)升高的(de)BCAT1如何在(zai)抗(kang)性細(xi)胞中(zhong)重編程支(zhi)(zhi)鏈(lian)氨(an)基酸(suan)（BCAAs）代謝。利用同(tong)位素示蹤將穩定表(biao)達(da)shCtrl或shBCAT1的(de)67R細(xi)胞與[13C]- Leu_M + 6和(he)[13C]-KIC_M + 2孵育(yu)，并分(fen)別分(fen)析它們的(de)特定代謝產物[13C]-KIC_M + 6和(he)[13C]-Leu_M+2（圖(tu)4a）。發(fa)現，BCAT1顯(xian)著降低了(le)[13C]-Leu_M + 2/[13C]- KIC_M + 2的(de)細(xi)胞比(bi)例，而不顯(xian)著影響[13C]-KIC_M + 6/ [13C]-Leu_M + 6的(de)比(bi)例。這(zhe)表(biao)明，在(zai)抗(kang)性細(xi)胞中(zhong)高表(biao)達(da)的(de)BCAT1可(ke)能比(bi)BCAA的(de)降解更能加(jia)速BCAA的(de)合成代謝（圖(tu)4b）。

作(zuo)者(zhe)證實(shi)了(le)(le)耐藥細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)BCAA合成代(dai)謝(xie)物(wu)的(de)變(bian)化，發現與親本NCI-H1975細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)相比(bi)，67R細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內α-KG顯(xian)(xian)著積(ji)累，而(er)總游(you)離BCAA含量保持不(bu)變(bian)（圖4c）。此外，BCAT1的(de)遺傳(chuan)或藥理抑(yi)制(zhi)導(dao)致(zhi)67R細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內α-KG水平的(de)顯(xian)(xian)著降低(di)，而(er)BCAT1的(de)下(xia)調或抑(yi)制(zhi)沒有(you)觀察(cha)到(dao)BCAA水平的(de)顯(xian)(xian)著降低(di)（圖4d，e）。這(zhe)些結(jie)(jie)果表(biao)(biao)明，耐藥細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)BCAT1的(de)上調主(zhu)要(yao)導(dao)致(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)α-KG的(de)積(ji)累，而(er)不(bu)是BCAAs的(de)積(ji)累。研究(jiu)人員探討(tao)了(le)(le)α-KG如(ru)何影響抗性細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)生(sheng)長。如(ru)圖4f所示，外源性補充(chong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)滲透性α- KG衍(yan)生(sheng)物(wu)（dimethyl-α-KG，DM-αKG）促進了(le)(le)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)集落的(de)形(xing)成，并顯(xian)(xian)著挽救了(le)(le)gabapentin對(dui)67R細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)抗腫瘤(liu)作(zuo)用。此外，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖實(shi)驗顯(xian)(xian)示，補充(chong)α-KG不(bu)僅挽救了(le)(le)gabapentin引起的(de)生(sheng)長抑(yi)制(zhi)作(zuo)用（圖4g），而(er)且還損害了(le)(le)加(jia)巴噴丁(ding)和ASK120067組合在(zai)67R細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)的(de)協(xie)同抗生(sheng)長作(zuo)用（圖3h和圖4h）。在(zai)AZDR細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)也觀察(cha)到(dao)類似的(de)結(jie)(jie)果。綜上所述，我(wo)們的(de)研究(jiu)結(jie)(jie)果表(biao)(biao)明，BCAA合成代(dai)謝(xie)產(chan)物(wu)α- KG的(de)增加(jia)有(you)助于BCAT1介導(dao)的(de)耐藥細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)存活。

圖4  α-KG產量(liang)的(de)增加參(can)與了BCAT1介(jie)導的(de)細(xi)胞生長(chang)和抗(kang)性

α-KG作為幾種表觀遺傳(chuan)修飾(shi)酶的(de)輔助(zhu)因子參(can)與(yu)了(le)細(xi)(xi)(xi)胞的(de)代(dai)謝調(diao)控(kong)，包括Jumonji-C（JmjC）家族的(de)賴(lai)氨酸去甲基化酶家族（KDMs）、TET甲基胞嘧啶雙加(jia)(jia)氧酶。作者首先評估了(le)已知(zhi)的(de)部分(fen)受α-KG依賴(lai)的(de)去甲基化酶調(diao)控(kong)的(de)組蛋(dan)白賴(lai)氨酸甲基化模式。與(yu)親本NCI-H1975細(xi)(xi)(xi)胞相比，67R細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)H3K27me3的(de)表達(da)顯(xian)著下降（圖(tu)5a）。后續實驗證(zheng)明BCAT1基因敲低(di)顯(xian)著增加(jia)(jia)了(le)H3K27me3的(de)整體表達(da)，而(er)補充α-KG則挽救了(le)這一(yi)表達(da)（圖(tu)5b），這表明在67R細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)高表達(da)的(de)BCAT1以α-KG依賴(lai)的(de)方(fang)式負(fu)調(diao)控(kong)H3K27me3。進一(yi)步用GSK-J4（細(xi)(xi)(xi)胞滲透性抑(yi)制(zhi)劑，抑(yi)制(zhi)KDM6A和KDM6B）處理(li)NCI-H1975和67R細(xi)(xi)(xi)胞，GSK-J4在67R耐(nai)藥細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)確實依賴(lai)性地上(shang)調(diao)了(le)H3K27me3，而(er)不影響NCI-H1975細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)H3K27me3的(de)水平（圖(tu)5c）。此(ci)外(wai)，GSK-J4處理(li)挽救了(le)bcat1敲低(di)的(de)67R細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)補充α-KG后H3K27me3水平的(de)下降（圖(tu)5d），表明KDM6A/6B在調(diao)節α-KG依賴(lai)的(de)H3K27me3去甲基化中(zhong)發揮了(le)重要作用。此(ci)外(wai)，與(yu)NCI-H1975細(xi)(xi)(xi)胞相比，GSK-J4在67R細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)表現出更(geng)強的(de)生長抑(yi)制(zhi)活性（圖(tu)5e），而(er)GSK-J4進一(yi)步使67R細(xi)(xi)(xi)胞對(dui)ASK120067抑(yi)制(zhi)致敏(min)（圖(tu)5f）。

圖5  BCAT1促進了抗性細(xi)胞中α-kg依(yi)賴的H3K27去(qu)甲(jia)基化

由于H3K27me3被報道為(wei)調節多種(zhong)生(sheng)物過(guo)程，推測(ce)(ce)α-KG介導的(de)(de)H3K27me3去甲基(ji)化導致(zhi)(zhi)靶基(ji)因的(de)(de)異常轉錄(lu)激活和(he)隨(sui)后的(de)(de)致(zhi)(zhi)癌(ai)信(xin)號，從而產生(sheng)耐(nai)藥性。通(tong)過(guo)分析臨床(chuang)數據集(ji)發(fa)現(xian)(xian)糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)/糖(tang)(tang)(tang)異生(sheng)途(tu)徑(jing)在BCAT1-高的(de)(de)肺腺癌(ai)樣本(ben)中(zhong)作為(wei)頂級差(cha)異途(tu)徑(jing)被富(fu)集(ji)（圖(tu)5g）。GSEA分析顯示，BCAT1的(de)(de)高表(biao)(biao)達(da)與糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)基(ji)因特征呈(cheng)正(zheng)相(xiang)關(guan)(guan)（圖(tu)5h）。接著(zhu)進行RNA-seq和(he)GSEA通(tong)路(lu)(lu)分析驗證BCAT1表(biao)(biao)達(da)和(he)糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)之間的(de)(de)相(xiang)關(guan)(guan)性，發(fa)現(xian)(xian)siRNA介導的(de)(de)BCAT1敲低導致(zhi)(zhi)糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)通(tong)路(lu)(lu)基(ji)因表(biao)(biao)達(da)顯著(zhu)降低，提示在抗性細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)，糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)相(xiang)關(guan)(guan)基(ji)因受到BCAT1的(de)(de)正(zheng)調控。為(wei)了探(tan)討糖(tang)(tang)(tang)代謝增(zeng)強是否與EGFR TKIs耐(nai)藥性有(you)關(guan)(guan)，評估(gu)了TKI耐(nai)藥細(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)NCI-H1975細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)的(de)(de)糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)活性，發(fa)現(xian)(xian)67R和(he)AZDR均表(biao)(biao)現(xian)(xian)出(chu)更(geng)高的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)外酸化率（ECAR）（圖(tu)6a）。然后，采用RT-qPCR檢測(ce)(ce)糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)相(xiang)關(guan)(guan)基(ji)因，發(fa)現(xian)(xian)其在67R和(he)AZDR細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)整體(ti)上調（圖(tu)6b和(he)補(bu)充圖(tu)7b）。重要的(de)(de)是，糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)抑(yi)制劑2-脫氧-d-葡(pu)萄糖(tang)(tang)(tang)顯著(zhu)使(shi)67R和(he)AZDR細(xi)胞(bao)(bao)(bao)對相(xiang)應(ying)的(de)(de)TKI處理致(zhi)(zhi)敏。這些(xie)結(jie)果表(biao)(biao)明，在EGFR TKI處理下，耐(nai)藥細(xi)胞(bao)(bao)(bao)表(biao)(biao)現(xian)(xian)出(chu)增(zeng)強的(de)(de)糖(tang)(tang)(tang)酵(jiao)(jiao)(jiao)解(jie)活性來支持細(xi)胞(bao)(bao)(bao)存活。

為了(le)(le)確定BCAT1誘導的葡萄糖代(dai)(dai)謝(xie)重編程是否依賴(lai)于(yu)α-KG介導的表(biao)(biao)(biao)觀遺(yi)傳調控，用(yong)α-KG進行了(le)(le)另一項拯救實驗。如圖(tu)6h和(he)補(bu)充圖(tu)6f所示(shi)，補(bu)充α-KG顯(xian)著(zhu)挽(wan)救了(le)(le)BCAT1敲(qiao)低或(huo)抑(yi)制(zhi)后糖酵解基(ji)因mRNA表(biao)(biao)(biao)達(da)下調的情況。此外，ChIP-qPCR分析顯(xian)示(shi)，在67R細(xi)胞和(he)AZDR細(xi)胞中，BCAT1敲(qiao)低導致PFKP和(he)LDHA啟動子上的H3K27me3的富集顯(xian)著(zhu)增加（圖(tu)6i）。綜(zong)上所述，這(zhe)些結果表(biao)(biao)(biao)明，BCAT1促(cu)(cu)進了(le)(le)BCAA合(he)成代(dai)(dai)謝(xie)和(he)α-KG依賴(lai)的H3K27me3去(qu)甲基(ji)化，從而轉(zhuan)錄激(ji)活(huo)糖酵解基(ji)因，促(cu)(cu)進細(xi)胞存活(huo)和(he)耐藥性（圖(tu)6j）。

圖6  BCAT1通(tong)過α-KG依(yi)賴的H3K27去(qu)甲基化(hua)轉錄激活糖(tang)酵解

靶向BCAT1有(you)(you)(you)(you)可(ke)能作(zuo)為(wei)一(yi)種克服EGFR TKI抗(kang)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)策略。然而，有(you)(you)(you)(you)效(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)BCAT1抑(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)用性(xing)有(you)(you)(you)(you)限(xian)，此研究篩選了(le)(le)一(yi)個具有(you)(you)(you)(you)獨特結構的(de)(de)(de)(de)(de)(de)γ-氨基丁酸（GABA）衍(yan)生物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)內部化合物庫，從(cong)而發現了(le)(le)WQQ-345作(zuo)為(wei)BCAT1抑(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)（圖7a），WQQ-345確實可(ke)靠地抑(yi)制(zhi)(zhi)了(le)(le)純化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)重組(zu)BCAT1蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)(de)活性(xing)（圖7b），其(qi)半抑(yi)制(zhi)(zhi)濃度值為(wei)10.8 mM。為(wei)了(le)(le)了(le)(le)解(jie)BCAT1和(he)WQQ-345之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子相互作(zuo)用，進行了(le)(le)分子對(dui)接(jie)(jie)分析。WQQ-345通過羧酸段和(he)氨基段與(yu)BCAT1活性(xing)位(wei)點殘(can)基（包括(kuo)Ala334、Tyr161和(he)Thr260）形成直(zhi)接(jie)(jie)氫(qing)鍵和(he)水介導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氫(qing)鍵（圖7c），有(you)(you)(you)(you)助于解(jie)釋WQQ-345對(dui)BCAT1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抑(yi)制(zhi)(zhi)能力。接(jie)(jie)下(xia)來(lai)采用細胞(bao)(bao)熱位(wei)移實驗(yan)(yan)來(lai)評估BCAT1在(zai)67R細胞(bao)(bao)中與(yu)藥物結合時(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)熱穩定(ding)性(xing)。同時(shi)(shi)，WQQ-345劑(ji)(ji)量依(yi)賴性(xing)地減少了(le)(le)67R耐(nai)藥細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)集落(luo)形成（圖7d），通過細胞(bao)(bao)增(zeng)殖(zhi)實驗(yan)(yan)進一(yi)步(bu)證實了(le)(le)其(qi)靶標抗(kang)生長(chang)作(zuo)用。此外，WQQ-345和(he)ASK120067或奧西(xi)替尼聯(lian)合治(zhi)療(liao)比(bi)單一(yi)治(zhi)療(liao)表現出(chu)更強的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)生長(chang)抑(yi)制(zhi)(zhi)（圖7e）。在(zai)機制(zhi)(zhi)上，WQQ-345處(chu)理導致細胞(bao)(bao)α-KG水平降(jiang)低，H3K27me3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達上調，并導致糖酵(jiao)解(jie)酶的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達降(jiang)低（PFKP和(he)LDHA），以及67R細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)糖酵(jiao)解(jie)活性(xing)受損（圖7f-i）。

進一(yi)步(bu)進行動物(wu)實(shi)驗以驗證WQQ-345在(zai)TKI耐藥(yao)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)中(zhong)(zhong)的體內(nei)效力(li)。如圖7j和補充圖8e所示，在(zai)67R中(zhong)(zhong)，口服120 mg/kg WQQ-345導致皮下異(yi)種(zhong)移植模型中(zhong)(zhong)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)顯(xian)著消退。此外，WQQ-345處理(li)與對照組相比，腫(zhong)(zhong)瘤(liu)中(zhong)(zhong)H3K27me3表達(da)(da)增加，PFKP、LDHA和PKM1/2表達(da)(da)水平(ping)降低（圖7k）。綜(zong)上所述，這些結(jie)果，證實(shi)了WQQ-345的抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)和抗糖(tang)酵解作用，這支持(chi)了藥(yao)理(li)抑制(zhi)BCAT1作為TKI耐藥(yao)NSCLC的潛在(zai)治療方法(fa)的觀點。

圖(tu)7  WQQ-345被鑒定為一種具有(you)抗(kang)腫瘤效力的(de)新(xin)型BCAT1抑制劑

總結：本研究闡明(ming)了(le)BCAT1介導(dao)的BCAA代(dai)謝(xie)重編程(cheng)在提高NSCLC細胞(bao)存(cun)活和TKI耐(nai)藥性中的意義。在機制上(shang)，BCAT1提高了(le)α- KG的產生，通(tong)過(guo)促進KDM6A/6b介導(dao)的H3K27去(qu)甲基化，促進糖酵(jiao)解基因的表達(da)，從(cong)而(er)增強糖酵(jiao)解、細胞(bao)存(cun)活和藥物(wu)耐(nai)受性，為直接靶向BCAT1作為肺癌治療策略提供了(le)廣泛的證據(ju)。