題目：Single-cell multi-omic and spatial profiling of human kidneys implicates the fibrotic microenvironment in kidney disease progression

中文題目(mu)：人類腎(shen)臟(zang)單細胞多組學(xue)和空間分析(xi)表明腎(shen)臟(zang)疾病(bing)進(jin)展中的纖維化微環境

期(qi)刊：nature genetics

影響因子：31.7

發(fa)表時間：2024年(nian)5月

技(ji)術手段(duan)：snRNA-seq、scRNA-seq、snATAC-seq 、Visium、CosMx

樣本信(xin)息(xi): 4個健康(kang)和11個患病的人(ren)類腎臟樣本

腎(shen)臟是人體復雜(za)的三維結(jie)構(gou)，但腎(shen)臟健康和疾(ji)病的空間和分(fen)子原(yuan)理仍未(wei)得到(dao)充分(fen)的了解。纖維化的嚴重程度可以作為(wei)(wei)慢性(xing)腎(shen)病（CKD）和確定哪些(xie)患者將要(yao)發展為(wei)(wei)終末(mo)期腎(shen)功(gong)能衰竭需要(yao)移植(zhi)或透析等臨床問題的一個預測因素，但一直(zhi)尚(shang)未(wei)受到(dao)重視。

雖(sui)然現(xian)有的一些技術如scRNA-seq、snRNA-seq、snATAC-seq等解析了腎臟的分子和(he)細(xi)胞(bao)(bao)組成(cheng)以及在發育和(he)疾病過程(cheng)中的變化(hua)，但(dan)空間(jian)信息的缺乏(fa)阻礙(ai)了對(dui)已知細(xi)胞(bao)(bao)類型的精確定位，限制了對(dui)局部基因表(biao)達變化(hua)和(he)細(xi)胞(bao)(bao)間(jian)通信的解析，不利于(yu)探索其在疾病中的失調，維持機體健康。

結(jie)果(guo)1：人(ren)類腎臟(zang)的(de)單(dan)細(xi)胞轉錄組(zu)圖(tu)譜(pu)

作(zuo)者對(dui)來自58名參與者人類(lei)(lei)健康對(dui)照(zhao)組(zu)（n=36）和CKD（n=45）的81例腎臟(zang)樣本，通過使用SCVI工具(ju)對(dui)來自snRNA-seq、scRNA-seq和snATAC-seq數據集的338,565個(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)/細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)核(he)的集合進(jin)行整合分析，鑒定(ding)出6大類(lei)(lei)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)型分別是內皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、基質細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、小(xiao)管(guan)上皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、免疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)型、腎小(xiao)球細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和神經/雪旺細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，在這些大類(lei)(lei)中確定(ding)了44種(zhong)主(zhu)要細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)型和114個(ge)(ge)不同的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)亞型（圖1a）。      

單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)單(dan)(dan)(dan)核人(ren)(ren)腎(shen)(shen)圖譜捕(bu)獲了(le)(le)腎(shen)(shen)臟(zang)所有解剖區域的(de)(de)健(jian)康和(he)(he)(he)(he)病(bing)變(bian)狀(zhuang)態下的(de)(de)腎(shen)(shen)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)，主要(yao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)主要(yao)為：足細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、不同類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)近(jin)端(duan)小管(guan)（PT）1-3段(duan)(PT_S1、S2、S3和(he)(he)(he)(he)損傷）、Henle下降薄(bo)(bo)環(huan)、上升薄(bo)(bo)環(huan)、皮(pi)質和(he)(he)(he)(he)髓質厚上升環(huan)（C_TAL和(he)(he)(he)(he)M_TAL）、遠端(duan)曲(qu)小管(guan)（DCT）、連接小管(guan)（CNT）、集合(he)管(guan)主細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（PC）、α型(xing)(xing)(xing)和(he)(he)(he)(he)β型(xing)(xing)(xing)夾(jia)層(ceng)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（IC_A和(he)(he)(he)(he)IC_B）、間(jian)質細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、內皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)等，也捕(bu)獲了(le)(le)一些罕見的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)，如11種不同類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)內皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)包括(kuo)傳入小動脈、傳出小動脈（FBLN5+）細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)(he)直腸血管(guan)（MCTP1+）細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（圖1b、c，擴展數(shu)(shu)據圖1），并鑒定了(le)(le)人(ren)(ren)類(lei)腎(shen)(shen)臟(zang)免(mian)疫細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)群(qun)，淋巴細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（T淋巴細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)CD4+（CD4T），T淋巴細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)CD8+（CD8T）、自然殺傷細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（NKT）、雙陰性(xing)T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、TH17、B_naive、B_intermediate 、B_memory和(he)(he)(he)(he)漿(jiang)(jiang)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)）和(he)(he)(he)(he)髓系細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（中性(xing)粒細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、嗜堿性(xing)粒細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)/肥大細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、CD14_單(dan)(dan)(dan)核細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、CD16_單(dan)(dan)(dan)核細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，巨噬細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、經典和(he)(he)(he)(he)漿(jiang)(jiang)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)樣樹突狀(zhuang)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，提供了(le)(le)全面的(de)(de)層(ceng)次聚類(lei)，包括(kuo)關于性(xing)別(bie)、疾病(bing)狀(zhuang)態、樣本身份和(he)(he)(he)(he)分(fen)析方法的(de)(de)信息（圖1d）。且為了(le)(le)進一步(bu)改進和(he)(he)(he)(he)驗證細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)和(he)(he)(he)(he)狀(zhuang)態的(de)(de)識(shi)別(bie)，作者將人(ren)(ren)腎(shen)(shen)圖譜與人(ren)(ren)類(lei)腎(shen)(shen)臟(zang)精(jing)準醫學項目（KPMP）數(shu)(shu)據集結合(he)，共獲得588425個(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)集合(he)，使用不同的(de)(de)分(fen)析方式驗證了(le)(le)數(shu)(shu)據集之間(jian)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)注釋的(de)(de)一致(zhi)性(xing)（圖1c，擴展數(shu)(shu)據圖2），構建(jian)了(le)(le)人(ren)(ren)類(lei)腎(shen)(shen)臟(zang)的(de)(de)單(dan)(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)轉錄組圖譜。

圖(tu)1：綜合(he)整(zheng)合(he)的多模態人腎單細(xi)胞圖(tu)譜。

擴展數據圖1：多模態單細胞圖譜

擴展數(shu)據圖2：多個(ge)來源的snRNA-seq、scRNA-seq和snATAC-seq數(shu)據集集成。

結果2：高空間(jian)分辨率(lv)下的人類(lei)腎臟圖(tu)譜

細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)識別的(de)(de)(de)(de)(de)一個(ge)(ge)關鍵限(xian)制(zhi)是(shi)缺乏高分辨率、空(kong)(kong)間(jian)分辨率的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉錄組學(xue)信息。為(wei)了克(ke)服這個(ge)(ge)限(xian)制(zhi)，作者利(li)(li)用(yong)Visium FFPE平臺和(he)(he)(he)CosMx平臺對(dui)樣本進(jin)(jin)行檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，產生(sheng)了spRNA-seq數(shu)(shu)據(ju)集(ji)，并利(li)(li)用(yong)分離(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)核/單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數(shu)(shu)據(ju)來識別空(kong)(kong)間(jian)數(shu)(shu)據(ju)集(ji)中的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)。首先對(dui)Visium數(shu)(shu)據(ju)利(li)(li)用(yong)cell2估算每種(zhong)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)觀察(cha)到的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因表達(da)譜，然后使(shi)(shi)用(yong)CellTrek，使(shi)(shi)用(yong)分離(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)將細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)位置(zhi)計(ji)算到接近單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)水平（計(ji)算后的(de)(de)(de)(de)(de)149,717個(ge)(ge)數(shu)(shu)據(ju)點(dian)），高分辨率的(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)可以將所有(you)已識別的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)從分離(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)集(ji)投(tou)影(ying)到它(ta)們的(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)(kong)間(jian)位置(zhi)，確(que)定了腎小球細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)，PT細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)，免疫和(he)(he)(he)纖維化(hua)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)，遠端(duan)小管細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)和(he)(he)(he)Henle細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)（圖2a，b）。作者進(jin)(jin)一步利(li)(li)用(yong)CosMx（NanoString）平臺在真(zhen)正的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分辨率下檢(jian)(jian)測(ce)(ce)人類(lei)腎臟樣本，分析了1000個(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)，生(sheng)成(cheng)了高質量的(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)集(ji)和(he)(he)(he)不同的(de)(de)(de)(de)(de)統一流形近似和(he)(he)(he)投(tou)影(ying)（UMAP）細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)簇，對(dui)應于特定腎細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)（擴展(zhan)數(shu)(shu)據(ju)圖3），與snRNA分離(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數(shu)(shu)據(ju)無縫集(ji)成(cheng)，進(jin)(jin)一步證(zheng)實了細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)注釋(shi)(shi)正確(que)（擴展(zhan)數(shu)(shu)據(ju)圖4）。此(ci)外，使(shi)(shi)用(yong)CosMx檢(jian)(jian)測(ce)(ce)驗證(zheng)了這些(xie)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)位置(zhi)，基(ji)(ji)(ji)于基(ji)(ji)(ji)因表達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)預(yu)測(ce)(ce)與載玻片的(de)(de)(de)(de)(de)解剖和(he)(he)(he)組織學(xue)注釋(shi)(shi)完(wan)全匹配（圖2b）。

圖2：空間分辨下的(de)人(ren)類腎臟(zang)細胞映射

擴(kuo)展數據圖(tu)3：CosMx平臺(tai)下細胞群的識別鑒(jian)定(ding)

擴展數據(ju)圖4：CosMx注釋(shi)和snRNA-seq注釋(shi)的(de)比較

結果3：纖維化中基質細胞的異質性和基質的產生

作者(zhe)在整合的(de)snRNA-seq/scRNA-seq和(he)(he)(he)snATAC-seq中分(fen)(fen)析(xi)了(le)(le)腎纖維(wei)化(hua)相關的(de)變(bian)化(hua)，因(yin)為纖維(wei)化(hua)是所(suo)(suo)有進展性(xing)CKD的(de)常見表(biao)現，通(tong)過結(jie)合膠原蛋白(bai)(bai)、糖(tang)蛋白(bai)(bai)和(he)(he)(he)蛋白(bai)(bai)聚(ju)糖(tang)基(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)表(biao)達情況計算(suan)ECM評(ping)(ping)(ping)分(fen)(fen)，結(jie)果顯示肌(ji)(ji)成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（myofibroblasts），其次(ci)是成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（fibroblasts），最后是血(xue)管平滑肌(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)/周細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（VSMC/pericytes）的(de)ECM評(ping)(ping)(ping)分(fen)(fen)最高（圖(tu)(tu)(tu)(tu)3a）。與(yu)健康樣本相比(bi)，疾病樣本的(de)肌(ji)(ji)成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)占比(bi)顯著增(zeng)多（圖(tu)(tu)(tu)(tu)3b），并(bing)且這(zhe)些(xie)肌(ji)(ji)成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)位于(yu)高ECM評(ping)(ping)(ping)分(fen)(fen)區(qu)域內（圖(tu)(tu)(tu)(tu)3c），組合的(de)數(shu)據(ju)集能夠(gou)識別(bie)基(ji)(ji)(ji)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞(ya)型，這(zhe)與(yu)以前(qian)的(de)研究和(he)(he)(he)數(shu)據(ju)集一(yi)致(擴展數(shu)據(ju)圖(tu)(tu)(tu)(tu)4和(he)(he)(he)5)且細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞(ya)型具(ju)有正確的(de)空(kong)(kong)間(jian)位置(zhi)(擴展數(shu)據(ju)圖(tu)(tu)(tu)(tu)6和(he)(he)(he)7）。對(dui)整合數(shu)據(ju)集中的(de)32,706個(ge)基(ji)(ji)(ji)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進行(xing)亞(ya)聚(ju)類分(fen)(fen)群(qun)，如前(qian)所(suo)(suo)述，作者(zhe)得到了(le)(le)基(ji)(ji)(ji)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中PDGFRB的(de)表(biao)達呈(cheng)陽性(xing)，能夠(gou)識別(bie)系(xi)膜細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（ITGA8和(he)(he)(he)POSTN）、VSMC/周細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（MYH11、NOTCH3和(he)(he)(he)NTRK3）、成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（KCNK2和(he)(he)(he)FAP）和(he)(he)(he)肌(ji)(ji)成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（COL1A1和(he)(he)(he)SYNPO2）的(de)標記物（圖(tu)(tu)(tu)(tu)3d、e），并(bing)使(shi)用MetaNowobibor工具(ju)驗(yan)證(zheng)了(le)(le)基(ji)(ji)(ji)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞(ya)型的(de)一(yi)致性(xing)和(he)(he)(he)它們的(de)空(kong)(kong)間(jian)位置(zhi)（圖(tu)(tu)(tu)(tu)3f）。作者(zhe)進一(yi)步(bu)對(dui)基(ji)(ji)(ji)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群(qun)進行(xing)KEGG功(gong)能富集分(fen)(fen)析(xi)，結(jie)果突出了(le)(le)不同基(ji)(ji)(ji)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)之間(jian)的(de)重要差異(yi)，如肌(ji)(ji)成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)顯示了(le)(le)病灶黏附和(he)(he)(he)TGFβ信號通(tong)路基(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)富集（圖(tu)(tu)(tu)(tu)3g）。

圖3：人類腎(shen)臟基質細胞圖譜(pu)

擴(kuo)展數據圖5：CosMx注釋的各細胞類群位(wei)置

擴展數據圖6：CosMx載(zai)玻片上腎臟(zang)各細胞類型的位(wei)置

擴(kuo)展數據圖7：CosMx載玻片細胞類(lei)群間的鄰域特(te)征

結果4：定(ding)義腎(shen)臟(zang)FME（纖維化(hua)微環境）

作(zuo)者利(li)用spRNA-seq對(dui)Visium數據(ju)集(ji)(ji)進(jin)(jin)(jin)(jin)行非負矩陣分(fen)解（NMF）定義的(de)(de)(de)(de)(de)人腎MEs（微(wei)環境），結果發(fa)現了(le)(le)四種主要的(de)(de)(de)(de)(de)ME，它(ta)們在(zai)(zai)(zai)視(shi)覺(jue)上對(dui)應(ying)于(yu)腎小球、腎小管、纖(xian)維化(hua)和(he)免(mian)(mian)疫(yi)區域，對(dui)每(mei)個(ge)MEs中檢測到的(de)(de)(de)(de)(de)基因(yin)進(jin)(jin)(jin)(jin)行GO富集(ji)(ji)分(fen)析(xi)并(bing)(bing)與解剖位(wei)置對(dui)應(ying)，計算(suan)定義FME與腎臟ECM基因(yin)表(biao)(biao)達(da)(da)，評估纖(xian)維化(hua)（圖(tu)(tu)4a）。通(tong)過ME與ECM評分(fen)、細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)(de)(de)相關性(xing)(xing)(xing)，以及利(li)用cell2、Celltrek和(he)CosMxd對(dui)病變腎臟樣(yang)本中FME中不同(tong)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)(de)(de)位(wei)置進(jin)(jin)(jin)(jin)行注釋，鑒定了(le)(le)一種特異(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)免(mian)(mian)疫(yi)ME，位(wei)于(yu)FME區域內，呈(cheng)斑片狀分(fen)布，免(mian)(mian)疫(yi)ME由樹突狀細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、漿細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、B淋(lin)(lin)巴(ba)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)T淋(lin)(lin)巴(ba)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)組成(cheng)(圖(tu)(tu)4b、c）。免(mian)(mian)疫(yi)性(xing)(xing)(xing)ME組織類似(si)于(yu)早期(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)三級淋(lin)(lin)巴(ba)樣(yang)結構，用細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類型特異(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)抗體(ti)進(jin)(jin)(jin)(jin)行的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)染色研究可(ke)證實這些(xie)特異(yi)(yi)性(xing)(xing)(xing)免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)聚集(ji)(ji)物的(de)(de)(de)(de)(de)存在(zai)(zai)(zai)，與Visium的(de)(de)(de)(de)(de)數據(ju)一致，作(zuo)者通(tong)過IMC（原(yuan)位(wei)質(zhi)譜）證實了(le)(le)iPT-HAVCR1+細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、B細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、CD4T細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、血漿、髓(sui)系和(he)內皮細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白表(biao)(biao)達(da)(da)（圖(tu)(tu)4d）。為(wei)了(le)(le)進(jin)(jin)(jin)(jin)一步了(le)(le)解FMEs中的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)相互(hu)作(zuo)用，作(zuo)者在(zai)(zai)(zai)集(ji)(ji)成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)scRNA-seq/snRNA-seq和(he)snATAC-seq數據(ju)集(ji)(ji)上實現了(le)(le)CellChat，并(bing)(bing)在(zai)(zai)(zai)spRNA-seq數據(ju)集(ji)(ji)上通(tong)過最優傳輸（COMMOT）進(jin)(jin)(jin)(jin)行通(tong)信分(fen)析(xi)，結果發(fa)現SPP1、CXCL12、CCL19、CCL21、PDGFB和(he)TGFB1及其(qi)受體(ti)在(zai)(zai)(zai)FME區域富集(ji)(ji)（圖(tu)(tu) 4e，擴展數據(ju)圖(tu)(tu)8）。FMEs中的(de)(de)(de)(de)(de)iPT細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)(biao)達(da)(da)SPP1和(he)PDGFB，并(bing)(bing)與基質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)有很(hen)強(qiang)的(de)(de)(de)(de)(de)相互(hu)作(zuo)用，此(ci)外還(huan)發(fa)現了(le)(le)在(zai)(zai)(zai)FME區域的(de)(de)(de)(de)(de)內皮細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)(biao)達(da)(da)CD34和(he)CDH5，基質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)富含CXCL12、CCL19和(he)CCL21等趨化(hua)因(yin)子，而其(qi)受體(ti)在(zai)(zai)(zai)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中表(biao)(biao)達(da)(da)，提示基質(zhi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)可(ke)能向免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)發(fa)出信號，在(zai)(zai)(zai)FME相關的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)聚集(ji)(ji)物中觀察(cha)到了(le)(le)PDGFB和(he)TGFB1，這些(xie)已知的(de)(de)(de)(de)(de)纖(xian)維化(hua)介質(zhi)（擴展數據(ju)圖(tu)(tu)8）。

圖:4：人腎臟(zang)纖維化微環(huan)境（FME）

擴展數據圖(tu)8：纖維(wei)化微環境中spRNA-seq數據集(ji)中的(de)細胞-細胞相互作用分(fen)析

結果5：人腎(shen)纖維化中損傷的腎(shen)小管(guan)細胞

FME的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型富(fu)集(ji)分析表明，FMEs中存在成(cheng)(cheng)纖(xian)(xian)維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、肌成(cheng)(cheng)纖(xian)(xian)維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、免疫細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、內皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)損傷的(de)(de)小管細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，包括(kuo)損傷的(de)(de)近(jin)端小管（iPT）細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（圖4b）。雖然iPT細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)尚未(wei)被很(hen)好(hao)的(de)(de)描述，但它們已(yi)經在患病的(de)(de)小鼠和(he)(he)(he)人類(lei)腎臟樣本中被鑒定出來，iPT細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)與PT細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)物理位置很(hen)接近(jin)（圖4c和(he)(he)(he)5a）。此外(wai)，作者(zhe)注(zhu)意到PT細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)表現(xian)出與eGFR和(he)(he)(he)纖(xian)(xian)維化相關(guan)的(de)(de)基因(yin)數量(liang)最(zui)多(duo)，而(er)疾病和(he)(he)(he)對(dui)照樣本之(zhi)間的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型分數變(bian)化最(zui)大（圖5b、c），相比之(zhi)下，ME中iPT細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)明顯富(fu)集(ji)，而(er)在患病樣本中數量(liang)增(zeng)加(jia)（圖5d）。作者(zhe)通過對(dui)CosMx數據進(jin)行(xing)仔細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)的(de)(de)亞聚(ju)類(lei)，發(fa)現(xian)VCAM1在PEC和(he)(he)(he)iPT中的(de)(de)表達，而(er)HAVCR1對(dui)iPT具(ju)有(you)特異(yi)性（圖5e和(he)(he)(he)擴展數據圖9）。

作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)(zhe)通過Visium數(shu)據(ju)，檢測iPT的(de)(de)(de)(de)異質(zhi)性(xing)(xing)，首先(xian)利用CellTrek的(de)(de)(de)(de)單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)共表達模塊，鑒(jian)定了(le)(le)兩種不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)iPT模塊，分別對(dui)(dui)(dui)應于(yu)患病(bing)樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)兩種iPT亞型（圖5f），而在(zai)“健康”樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)只對(dui)(dui)(dui)應于(yu)一種iPT亞型。回(hui)到豐富(fu)的(de)(de)(de)(de)整合圖譜，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)(zhe)發(fa)現(xian)其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)一個iPT簇表達了(le)(le)VCAM1、ACSL1、ASS1和(he)(he)(he)ASPA，這(zhe)(zhe)些基因在(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)代謝中(zhong)(zhong)起作(zuo)(zuo)(zuo)用，定義這(zhe)(zhe)個集(ji)(ji)群為iPT_VCAM1+，該聚(ju)類存(cun)在(zai)于(yu)健康樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)，且該聚(ju)類與(yu)表達MT1等線粒體基因的(de)(de)(de)(de)整合數(shu)據(ju)集(ji)(ji)中(zhong)(zhong)其(qi)(qi)他損傷的(de)(de)(de)(de)PT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)很接近(jin)(jin)（圖5f）。第(di)二個iPT簇表達HAVCR1（編(bian)碼(ma)KIM1）、NFKBIZ、IL-18、ITGA3、PDGFB和(he)(he)(he)ITGB1，并(bing)富(fu)集(ji)(ji)表達與(yu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)粘附和(he)(he)(he)基質(zhi)相(xiang)關(guan)(guan)的(de)(de)(de)(de)基因（iPT-HAVCR1+），在(zai)Visium空(kong)間數(shu)據(ju)集(ji)(ji)和(he)(he)(he)分離(li)數(shu)據(ju)集(ji)(ji)中(zhong)(zhong)，大多數(shu)iPT-HAVCR1+細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)都在(zai)CKD樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)（圖5g）。使用Monocle對(dui)(dui)(dui)PT和(he)(he)(he)iPT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進行擬時間分析，發(fa)現(xian)PT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)向iPT_VCAM1+和(he)(he)(he)iPT_HAVCR1+的(de)(de)(de)(de)連續分化路(lu)徑(jing)（圖5h）。其(qi)(qi)次，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)(zhe)通過已經(jing)位(wei)置(zhi)驗證的(de)(de)(de)(de)CosMx數(shu)據(ju)對(dui)(dui)(dui)iPT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進行亞聚(ju)類，結果發(fa)現(xian)iPT的(de)(de)(de)(de)異質(zhi)性(xing)(xing)與(yu)鄰近(jin)(jin)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)身(shen)份相(xiang)對(dui)(dui)(dui)應（擴展數(shu)據(ju)圖9），這(zhe)(zhe)為Visium數(shu)據(ju)提供了(le)(le)支撐，即iPT亞群共定位(wei)，并(bing)可(ke)能與(yu)潛在(zai)的(de)(de)(de)(de)ME相(xiang)關(guan)(guan)。在(zai)CosMx數(shu)據(ju)集(ji)(ji)中(zhong)(zhong)，APOE、SPP1和(he)(he)(he)KRT7（擴展數(shu)據(ju)圖9b）標(biao)記了(le)(le)這(zhe)(zhe)些子簇，與(yu)其(qi)(qi)他iPT marker相(xiang)比，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)(zhe)對(dui)(dui)(dui)這(zhe)(zhe)些特異性(xing)(xing)marker的(de)(de)(de)(de)識別可(ke)能與(yu)CosMx平臺與(yu)整個轉錄組(zu)方法相(xiang)比所使用的(de)(de)(de)(de)轉錄本(ben)相(xiang)對(dui)(dui)(dui)較少有關(guan)(guan)。總(zong)之(zhi)，不(bu)同(tong)類型的(de)(de)(de)(de)單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)組(zu)學數(shu)據(ju)表明了(le)(le)一個高度(du)可(ke)塑性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)PT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群，包(bao)括iPT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。SP分析強調了(le)(le)不(bu)同(tong)類型的(de)(de)(de)(de)iPT細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（VCAM1+和(he)(he)(he)HAVCR1+），在(zai)非ckd成人腎(shen)臟(zang)樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)觀察到VCAM+ iPT和(he)(he)(he)PEC細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，而HAVCR1+細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在(zai)FME和(he)(he)(he)病(bing)變腎(shen)臟(zang)中(zhong)(zhong)富(fu)集(ji)(ji)。

圖5：在患病的人腎臟(zang)中的iPT細胞

擴(kuo)展數據圖9：CosMx上損(sun)傷(shang)PT亞(ya)群的空間特征(zheng)

結果6：FME基因可預測疾病進(jin)展

     作(zuo)者(zhe)(zhe)為(wei)了驗證spRNA-seq是否有(you)(you)助于(yu)(yu)疾病(bing)分(fen)(fen)類和預后評估，首先生成了一個(ge)FME基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)特(te)征（FME-GS），并使(shi)用該基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)特(te)征基(ji)(ji)于(yu)(yu)空間(jian)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)表達(da)信息進(jin)行分(fen)(fen)析(xi)，其(qi)中(zhong)包含(han)292個(ge)人類腎臟(zang)（圖(tu)6a），包括健康樣(yang)(yang)本(ben)和不同(tong)嚴重(zhong)程度的(de)(de)(de)(de)CKD樣(yang)(yang)本(ben)（歸因(yin)(yin)(yin)(yin)于(yu)(yu)糖尿病(bing)和高(gao)血壓），FME-GS成功地(di)將患(huan)有(you)(you)更(geng)(geng)嚴重(zhong)疾病(bing)（纖(xian)維(wei)(wei)化(hua)程度更(geng)(geng)高(gao)，eGFR更(geng)(geng)低）的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)與更(geng)(geng)健康的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)完全區分(fen)(fen)開來(lai)（圖(tu)6b、c），盡管這些參數未包含(han)在聚(ju)(ju)類算法中(zhong)。接下(xia)來(lai)，為(wei)了了解(jie)FME-GS是否可以預測腎臟(zang)疾病(bing)的(de)(de)(de)(de)預后，作(zuo)者(zhe)(zhe)在結果(guo)中(zhong)發現細(xi)(xi)(xi)胞(bao)簇(cu)1亞群，具有(you)(you)最(zui)高(gao)FME-GS負荷的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)，達(da)到終點的(de)(de)(de)(de)幾率高(gao)出(chu)(chu)4倍，定義為(wei)eGFR有(you)(you)40%的(de)(de)(de)(de)變化(hua)或達(da)到終末(mo)期腎衰竭（eGFR<15mlmin?1；圖(tu)6c）。然(ran)而，亞組分(fen)(fen)析(xi)顯示(shi)，FME-GS最(zui)高(gao)的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)(de)(de)纖(xian)維(wei)(wei)化(hua)程度在統(tong)計(ji)(ji)學上更(geng)(geng)高(gao)，分(fen)(fen)別為(wei)12.1%和6.51%。雖然(ran)這種差異很小，但(dan)差異具有(you)(you)統(tong)計(ji)(ji)學意(yi)義。最(zui)后，作(zuo)者(zhe)(zhe)想(xiang)了解(jie)FME-GS是否也可以預測eGFR保留患(huan)者(zhe)(zhe)的(de)(de)(de)(de)腎臟(zang)疾病(bing)進(jin)展和最(zui)小可觀察到的(de)(de)(de)(de)結構損傷(shang)，使(shi)用這些參數定義缺(que)乏結構性(xing)和功能性(xing)腎損傷(shang)（CKD/纖(xian)維(wei)(wei)化(hua)）（圖(tu)6d）。病(bing)理學報告顯示(shi)纖(xian)維(wei)(wei)化(hua)評分(fen)(fen)無法預測這些樣(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)(de)(de)結果(guo)（圖(tu)6e）。Kaplan-Meier分(fen)(fen)析(xi)表明，FME-GS負荷最(zui)高(gao)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)簇(cu)1達(da)到終點時HR顯著升(sheng)高(gao)（圖(tu)6e）。雖然(ran)整(zheng)個(ge)FME基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)集(ji)可以更(geng)(geng)好地(di)預測結果(guo)，但(dan)僅使(shi)用最(zui)小絕對收(shou)縮和選(xuan)擇算子(zi)中(zhong)（LASSO）回歸的(de)(de)(de)(de)前十個(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)仍顯示(shi)出(chu)(chu)腎衰竭有(you)(you)統(tong)計(ji)(ji)學意(yi)義的(de)(de)(de)(de)富集(ji)（P=0.021；擴(kuo)展數據圖(tu)10）。使(shi)用隨機基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)集(ji)對樣(yang)(yang)本(ben)進(jin)行聚(ju)(ju)類沒有(you)(you)相關性(xing)結果(guo)，通過分(fen)(fen)析(xi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型與腎臟(zang)疾病(bing)進(jin)展之間(jian)的(de)(de)(de)(de)關系，發現基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)與eGFR斜率相關的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)富含(han)iPT和基(ji)(ji)質細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，這可能暗示(shi)了它們的(de)(de)(de)(de)因(yin)(yin)(yin)(yin)果(guo)作(zuo)用（擴(kuo)展數據圖(tu)10）。

圖(tu)6：FME-GS對(dui)大樣本中疾病預后的預測

擴展數據圖10：FME基因的表達可預測腎臟的預后。

綜上(shang)所述，該(gai)研究利用(yong)單細(xi)胞(bao)組(zu)(zu)學數據（scRNA-seq，snRNA-seq和(he)snATAC-seq）與空(kong)間轉錄組(zu)(zu)測序（spRNA-seq,Visium FFPE和(he)CosMx）技(ji)術(shu)結合，構建了(le)全面且空(kong)間分(fen)辨率(lv)高的(de)(de)人類(lei)腎(shen)臟圖譜(pu)，填補了(le)腎(shen)臟健康和(he)疾(ji)病的(de)(de)空(kong)間分(fen)子(zi)原理的(de)(de)知(zhi)識空(kong)白，揭示(shi)了(le)腎(shen)臟纖(xian)維化中基(ji)質細(xi)胞(bao)的(de)(de)異質性，定義(yi)了(le)腎(shen)臟各種組(zu)(zu)織(zhi)的(de)(de)微(wei)環境包(bao)括纖(xian)維化微(wei)環境（FME）, 展示(shi)了(le) FME 作為臨床有(you)意(yi)義(yi)的(de)(de)預(yu)后疾(ji)病生(sheng)物標志物的(de)(de)作用(yong)。總之，該(gai)研究為腎(shen)臟疾(ji)病的(de)(de)研究提供了(le)新的(de)(de)視角(jiao)和(he)有(you)價(jia)值的(de)(de)信(xin)息，有(you)助于(yu)深入理解腎(shen)臟健康和(he)疾(ji)病的(de)(de)機制，并為疾(ji)病的(de)(de)診斷(duan)和(he)治療提供了(le)潛在(zai)的(de)(de)靶點。