SPATAC-seq是通(tong)(tong)過(guo)四(si)輪(lun)組合索引(yin)(yin)對單細(xi)胞核(he)染色質片段進(jin)(jin)(jin)行原位(wei)標(biao)記的測序(xu)方法，將斑(ban)馬(ma)魚胚胎抽核(he)后利用0.5%甲醛(quan)固(gu)定后，進(jin)(jin)(jin)行四(si)輪(lun)標(biao)記（圖1a）。首先將固(gu)定后的細(xi)胞核(he)置于(yu)48個(ge)含有不(bu)(bu)同Tn5轉座酶(mei)(mei)的PCR孔(kong)中進(jin)(jin)(jin)行轉座反應(ying)，其中Tn5轉座酶(mei)(mei)接頭(tou)不(bu)(bu)僅包(bao)含不(bu)(bu)同的Barcode，而且在5’端進(jin)(jin)(jin)行磷酸化(hua)修飾。收(shou)集48孔(kong)細(xi)胞核(he)并隨機重(zhong)新分配，依(yi)次(ci)加入第二、第三輪(lun)的48孔(kong)板(ban)，PCR孔(kong)中不(bu)(bu)同Barcode通(tong)(tong)過(guo)T4連(lian)接酶(mei)(mei)分別連(lian)接至兩端磷酸化(hua)位(wei)點，進(jin)(jin)(jin)行兩輪(lun)標(biao)記，從而產生483個(ge)獨(du)特的Barcode組合。再(zai)次(ci)收(shou)集48孔(kong)細(xi)胞核(he)并重(zhong)新分配至96孔(kong)板(ban)中，加入i5、i7 index進(jin)(jin)(jin)行PCR，引(yin)(yin)入第四(si)輪(lun)標(biao)簽，建庫(ku)后上機測序(xu)。四(si)輪(lun)標(biao)記后可(ke)產生的Barcode理論上可(ke)分析上百萬細(xi)胞，并且可(ke)以通(tong)(tong)過(guo)增(zeng)加每一輪(lun)Barcode數量來增(zeng)加細(xi)胞通(tong)(tong)量。

為驗證SPATAC-seq的(de)保(bao)真(zhen)度，作(zuo)者(zhe)將人K562和小鼠Hepa細胞(bao)混合后(hou)進行實驗，結果表(biao)明SPATAC-seq信號在(zai)轉(zhuan)錄起始區域（TSS）顯示強富(fu)集，片段分(fen)(fen)布(bu)顯示典型的(de)核(he)小體相位模式(shi)（圖1b），與(yu)之(zhi)前研究結果一(yi)致（圖1c-e）。與(yu)現(xian)有scATAC-seq技術對比發(fa)現(xian)，SPATAC-seq在(zai)獨特片段數量(liang)、TSS富(fu)集分(fen)(fen)數、有效Barcode等指標上表(biao)現(xian)出相似(si)的(de)性能(neng)（圖1f,g）。最后(hou)，作(zuo)者(zhe)分(fen)(fen)析時發(fa)現(xian)雙胞(bao)率(lv)僅(jin)為2.6%，與(yu)理論值(zhi)高度相似(si)（圖1h,i）。

總(zong)而(er)言之，SPATAC-seq與現有技術相比具有更(geng)高的細(xi)胞通量、更(geng)低的雙胞率和更(geng)低的成本，是一種強大而(er)可(ke)靠的分析(xi)染色質(zhi)可(ke)及性的方(fang)法。

為了全面表(biao)征斑馬魚胚胎發育過(guo)程中(zhong)基因(yin)組可(ke)(ke)(ke)及性(xing)(xing)(xing)區域，作者利用SPATAC-seq分析(xi)了整(zheng)個(ge)(ge)胚胎在(zai)(zai)4-72 hpf的(de)(de)(de)20個(ge)(ge)發育階段的(de)(de)(de)染色(se)質(zhi)(zhi)(zhi)可(ke)(ke)(ke)及性(xing)(xing)(xing)（圖(tu)2a），獲得了808,046個(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)高(gao)質(zhi)(zhi)(zhi)量染色(se)質(zhi)(zhi)(zhi)可(ke)(ke)(ke)及性(xing)(xing)(xing)譜(pu)（圖(tu)2b,c）。作為對比(bi)，作者選(xuan)擇10x Genomics的(de)(de)(de)scATAC-seq試劑盒分析(xi)24,48和72 hpf的(de)(de)(de)80,767個(ge)(ge)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)染色(se)質(zhi)(zhi)(zhi)可(ke)(ke)(ke)及性(xing)(xing)(xing)（圖(tu)2a）。作者通過(guo)已發表(biao)scRNA-seq數據(ju)和細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)注釋(shi)預測scATAC -seq細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)（圖(tu)2d），在(zai)(zai)10 hpf下識別出23種不同的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)（圖(tu)2e,f），通過(guo)人工(gong)檢查典型(xing)標(biao)記(ji)基因(yin)的(de)(de)(de)染色(se)質(zhi)(zhi)(zhi)可(ke)(ke)(ke)及性(xing)(xing)(xing)進一步確認了細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)身份（圖(tu)2g），scRNA-seq和scATAC-seq的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)特異性(xing)(xing)(xing)標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)基因(yin)表(biao)達模(mo)式顯示出高(gao)度一致性(xing)(xing)(xing)（圖(tu)2h-j）。

作者(zhe)在20個發育階(jie)段(duan)中將所(suo)有細(xi)胞分為(wei)604種細(xi)胞狀態(tai)，注(zhu)釋了82種細(xi)胞類型，同時發現SPATAC-seq與10x scATAC-seq細(xi)胞豐度高(gao)(gao)度相關(guan)，證明(ming)了SPATAC-seq在分析斑(ban)馬魚胚胎方面的(de)高(gao)(gao)保(bao)真(zhen)度，是理解發育時間(jian)內動態(tai)細(xi)胞組(zu)成的(de)復雜性(xing)的(de)重要(yao)工具。

圖(tu)2 斑馬魚發育的單(dan)細胞(bao)染色(se)質圖(tu)譜和(he)細胞(bao)類型的整合(he)分析注(zhu)釋

作者整合了來自不(bu)同(tong)實驗批次和技(ji)術(shu)平(ping)臺的(de)(de)(de)888,813個細(xi)胞(bao)繪(hui)制UMAP，并根據發(fa)育(yu)階段進(jin)行著色，結果發(fa)現隨著發(fa)育(yu)時間(jian)的(de)(de)(de)增(zeng)加，細(xi)胞(bao)多樣性也隨之(zhi)增(zeng)加（圖3a），鑒定36種主要的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)（圖3b），并且發(fa)現了某些持(chi)續(xu)性細(xi)胞(bao)類型(xing)(xing)經(jing)歷(li)了漸進(jin)式分(fen)(fen)(fen)化(hua)（如視網膜細(xi)胞(bao)，圖3c,d）。為了清晰地(di)顯示斑馬魚(yu)胚胎發(fa)育(yu)過程中不(bu)同(tong)細(xi)胞(bao)系的(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)化(hua)途徑(jing)，作者生成了包含(han)603個節點和635條邊(bian)的(de)(de)(de)有向(xiang)無(wu)環圖（圖3f、g），可以通過從(cong)不(bu)同(tong)分(fen)(fen)(fen)支中分(fen)(fen)(fen)離細(xi)胞(bao)，從(cong)而剖析每個譜(pu)系細(xi)胞(bao)分(fen)(fen)(fen)化(hua)的(de)(de)(de)基因調控程序。

圖(tu)3 UMAP可視(shi)化顯示了(le)斑馬(ma)魚(yu)胚胎發育期間(jian)細(xi)胞類型變化及染(ran)色質可及性圖(tu)譜。

為(wei)(wei)(wei)表(biao)(biao)(biao)征斑(ban)馬魚(yu)(yu)胚胎(tai)(tai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)調(diao)控程序，作(zuo)者(zhe)(zhe)在(zai)(zai)20個(ge)發(fa)(fa)育(yu)(yu)階(jie)(jie)段中(zhong)(zhong)(zhong)鑒定(ding)了(le)CREs。作(zuo)者(zhe)(zhe)對信號(hao)峰進(jin)(jin)行富集(ji)分(fen)析，繪制了(le)斑(ban)馬魚(yu)(yu)胚胎(tai)(tai)發(fa)(fa)育(yu)(yu)過(guo)程中(zhong)(zhong)(zhong)959,040個(ge)cCREs的(de)(de)(de)綜合圖(tu)(tu)(tu)譜（占斑(ban)馬魚(yu)(yu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組的(de)(de)(de)35.7%），其(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)，46.4%和(he)38.6%的(de)(de)(de)CRE分(fen)別位(wei)于(yu)內含(han)子區(qu)和(he)遠端基(ji)(ji)因(yin)(yin)間區(qu)，表(biao)(biao)(biao)明(ming)所鑒定(ding)的(de)(de)(de)CRE大多位(wei)于(yu)遠端元件（圖(tu)(tu)(tu)4a,b）。與以(yi)往研究對比發(fa)(fa)現(xian)，SPATAC-seq可(ke)(ke)以(yi)檢測更罕見的(de)(de)(de)細胞類型峰值（圖(tu)(tu)(tu)4c,d），在(zai)(zai)識別斑(ban)馬魚(yu)(yu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組中(zhong)(zhong)(zhong)更微(wei)妙的(de)(de)(de)調(diao)控元件方面(mian)具有優勢。與靜止狀態(tai)相(xiang)比，這些cCREs在(zai)(zai)活(huo)躍的(de)(de)(de)啟動子和(he)增強子區(qu)域顯(xian)著富集(ji)，且它(ta)們的(de)(de)(de)序列保守性高于(yu)隨(sui)機基(ji)(ji)因(yin)(yin)組區(qu)域（圖(tu)(tu)(tu)4e,f），進(jin)(jin)一步證(zheng)實了(le)它(ta)們在(zai)(zai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)調(diao)控中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)潛在(zai)(zai)作(zuo)用。PCA分(fen)析顯(xian)示斑(ban)馬魚(yu)(yu)胚胎(tai)(tai)的(de)(de)(de)軌跡分(fen)布與發(fa)(fa)育(yu)(yu)時間的(de)(de)(de)進(jin)(jin)展密切相(xiang)關（圖(tu)(tu)(tu)4h），同時發(fa)(fa)現(xian)，在(zai)(zai)胚胎(tai)(tai)水平上，不同發(fa)(fa)育(yu)(yu)階(jie)(jie)段的(de)(de)(de)染(ran)色(se)質(zhi)可(ke)(ke)及(ji)性不同（圖(tu)(tu)(tu)4i）。為(wei)(wei)(wei)了(le)系統地(di)評估斑(ban)馬魚(yu)(yu)胚胎(tai)(tai)發(fa)(fa)生過(guo)程中(zhong)(zhong)(zhong)染(ran)色(se)質(zhi)可(ke)(ke)及(ji)性的(de)(de)(de)時間動態(tai)，作(zuo)者(zhe)(zhe)確定(ding)了(le)102,397個(ge)與發(fa)(fa)育(yu)(yu)相(xiang)關的(de)(de)(de)動態(tai)cCREs，將(jiang)其(qi)分(fen)為(wei)(wei)(wei)16個(ge)模塊(kuai)（圖(tu)(tu)(tu)4j），為(wei)(wei)(wei)了(le)驗(yan)證(zheng)這些動態(tai)cCREs的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)調(diao)控作(zuo)用，作(zuo)者(zhe)(zhe)利(li)用已發(fa)(fa)表(biao)(biao)(biao)RNA-seq數據(ju)計算(suan)每個(ge)模塊(kuai)中(zhong)(zhong)(zhong)每個(ge)峰最近的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)在(zai)(zai)12個(ge)發(fa)(fa)育(yu)(yu)階(jie)(jie)段的(de)(de)(de)平均表(biao)(biao)(biao)達(da)量（圖(tu)(tu)(tu)4k），結果表(biao)(biao)(biao)明(ming)其(qi)表(biao)(biao)(biao)現(xian)出與圖(tu)(tu)(tu)4j所示的(de)(de)(de)cCREs相(xiang)似(si)的(de)(de)(de)動態(tai)模式。

圖4 斑(ban)馬魚發育過程(cheng)中cCRE圖譜的鑒定與表征

為了推(tui)斷轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)基序(xu)的(de)(de)(de)活(huo)(huo)性(xing)，作(zuo)者對24 hpf斑馬魚(yu)胚(pei)胎的(de)(de)(de)46種細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)活(huo)(huo)性(xing)進行聚類(lei)和(he)偏(pian)倚校(xiao)正，得(de)到了揭示基序(xu)可及性(xing)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)或譜系特(te)(te)異性(xing)模(mo)式(shi)（圖(tu)5a），并識別(bie)了細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)身份的(de)(de)(de)關鍵(jian)調節(jie)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)（圖(tu)5b），通過全基因(yin)(yin)組轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)足(zu)跡(ji)分析(xi)進一步揭示了關鍵(jian)譜系定(ding)義(yi)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)激活(huo)(huo)（圖(tu)5c）。作(zuo)者將同源基序(xu)活(huo)(huo)性(xing)與(yu)相應轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)表達結合起來，預(yu)測細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)特(te)(te)異性(xing)調節(jie)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)，以24hpf為例，作(zuo)者對46種主要細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)所(suo)有轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)進行了分析(xi)，確定(ding)了115個(ge)假(jia)定(ding)的(de)(de)(de)激活(huo)(huo)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)和(he)16個(ge)假(jia)定(ding)的(de)(de)(de)抑(yi)制因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)（圖(tu)5d），并且(qie)能夠發現在特(te)(te)定(ding)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)特(te)(te)定(ding)階段發現轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)特(te)(te)定(ding)轉(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)（圖(tu)5e）。

總而言(yan)之(zhi)，以(yi)上(shang)結果強(qiang)調了轉(zhuan)錄因子活性是(shi)細胞類型(xing)定義的重(zhong)要特征之(zhi)一(yi)。

圖5 鑒定每種細胞類型的潛在主(zhu)調控因子

為驗證細胞類型(xing)特異性(xing)(xing)調節元件(jian)是否在(zai)體內作(zuo)為假定(ding)的(de)器(qi)官或組織(zhi)特異性(xing)(xing)增(zeng)(zeng)強(qiang)子(zi)(zi)元件(jian)起(qi)作(zuo)用(yong)，作(zuo)者選擇基(ji)(ji)于(yu)綠色(se)熒(ying)光蛋白(bai)（GFP）的(de)斑馬魚胚胎(tai)進行實驗（圖6a,b），測試了40個細胞類型(xing)特異性(xing)(xing)基(ji)(ji)因中(zhong)的(de)100個染色(se)質可及性(xing)(xing)區域，其(qi)中(zhong)65%顯示出特異性(xing)(xing)的(de)增(zeng)(zeng)強(qiang)（eGFP）表(biao)(biao)達（圖6c-e）。接下來作(zuo)者通過干擾cdh5基(ji)(ji)因附近增(zeng)(zeng)強(qiang)子(zi)(zi)的(de)基(ji)(ji)序(xu)(xu)結構(gou)，測定(ding)同源(yuan)基(ji)(ji)序(xu)(xu)結構(gou)的(de)擾動對(dui)增(zeng)(zeng)強(qiang)子(zi)(zi)報告活性(xing)(xing)的(de)影響，結果發(fa)現去除特定(ding)轉錄因子(zi)(zi)結合位點(dian)可以在(zai)很大程度(du)上(shang)影響增(zeng)(zeng)強(qiang)子(zi)(zi)的(de)活性(xing)(xing)，甚至使(shi)增(zeng)(zeng)強(qiang)子(zi)(zi)失去活性(xing)(xing)（圖f,g），表(biao)(biao)明這(zhe)些增(zeng)(zeng)強(qiang)子(zi)(zi)在(zai)細胞類型(xing)特異性(xing)(xing)基(ji)(ji)因表(biao)(biao)達調控中(zhong)發(fa)揮(hui)重要作(zuo)用(yong)。

圖6 在(zai)體(ti)內(nei)驗證假定的細(xi)胞類型(xing)特異(yi)性增強子元件

作(zuo)(zuo)者以色素細(xi)胞(bao)和(he)脊索(suo)細(xi)胞(bao)為例，詳(xiang)細(xi)描述(shu)了(le)分(fen)化(hua)過(guo)程。作(zuo)(zuo)者將色素細(xi)胞(bao)譜系分(fen)為四個不同(tong)的(de)亞群（圖(tu)(tu)7a-c），并根據先前開發方法確定與(yu)色素細(xi)胞(bao)分(fen)化(hua)相(xiang)關(guan)cCREs（圖(tu)(tu)7d），并確定cCRE-基(ji)因(yin)(yin)鏈(lian)接，這些鏈(lian)接代表了(le)潛在的(de)增強基(ji)因(yin)(yin)相(xiang)互作(zuo)(zuo)用（圖(tu)(tu)7e），根據cCRE可(ke)及性和(he)基(ji)因(yin)(yin)評分(fen)的(de)共變可(ke)以明(ming)顯區分(fen)四個不同(tong)的(de)細(xi)胞(bao)亞群（圖(tu)(tu)7f），通過(guo)對cCRE-基(ji)因(yin)(yin)中cCREs進行基(ji)序富集，發現了(le)與(yu)亞群特異性調(diao)控(kong)程序相(xiang)關(guan)的(de)轉錄(lu)因(yin)(yin)子（圖(tu)(tu)7g）。

與(yu)色素(su)細(xi)胞(bao)類(lei)似，脊(ji)索細(xi)胞(bao)隨(sui)時間分(fen)成兩個不同的分(fen)支（圖7h），將其分(fen)為四種類(lei)型（圖7i），C1和(he)C2分(fen)別代(dai)表前體細(xi)胞(bao)和(he)中間細(xi)胞(bao)，幾(ji)乎完全來自于7-20 hpf；C4位于一個分(fen)支的末端，在(zai)許多軟骨特有的基因中顯示(shi)出(chu)高可及(ji)性，代(dai)表晚(wan)期鞘細(xi)胞(bao)；C3為空(kong)泡細(xi)胞(bao)，在(zai)ngs和(he)pacsin3中特異可及(ji)（圖7j）。作者(zhe)(zhe)鑒定7,117個差異可及(ji)cCREs （圖7k），富(fu)集分(fen)析(xi)顯示(shi)顯示(shi)脊(ji)索細(xi)胞(bao)分(fen)化和(he)胚胎器官發育(yu)等(deng)生(sheng)物(wu)過程(cheng)在(zai)C3和(he)C4的DAEs中均富(fu)集（圖7l），但(dan)在(zai)與(yu)軟骨相關(guan)的生(sheng)物(wu)過程(cheng)則(ze)在(zai)C4中富(fu)集（圖7m）；作者(zhe)(zhe)通(tong)過基序富(fu)集分(fen)析(xi)推(tui)斷出(chu)參與(yu)脊(ji)索細(xi)胞(bao)特化的潛在(zai)轉錄(lu)調(diao)控(kong)因子（圖7n），最終確定在(zai)脊(ji)索細(xi)胞(bao)分(fen)化中起關(guan)鍵作用的基因調(diao)控(kong)網絡（圖7o）。

圖7 色素(su)細(xi)胞(bao)和脊(ji)索細(xi)胞(bao)分化的基因(yin)調(diao)控程序(xu)的表征(zheng)

綜上所述，作(zuo)者介(jie)紹了一種規模化、低成本和(he)高通量的(de)(de)基于組合索引的(de)(de)scATAC-seq方法(fa)，不僅性能與已發表方法(fa)相當，而且兼容Illumina測序。作(zuo)者利用(yong)SPATAC-seq繪制了斑馬(ma)魚胚胎發育(yu)過(guo)程(cheng)(cheng)染(ran)色質可及性圖(tu)譜，通過(guo)ZEPA數(shu)據集研究驅(qu)動細(xi)胞(bao)譜系指定過(guo)程(cheng)(cheng)的(de)(de)cCREs和(he)轉(zhuan)錄因子(zi)(zi)描述定義(yi)細(xi)胞(bao)身份(fen)的(de)(de)潛在(zai)主調控(kong)因子(zi)(zi)，為深入探(tan)索生(sheng)物發育(yu)過(guo)程(cheng)(cheng)中基因調控(kong)機制提(ti)供了新視角。作(zuo)者提(ti)出，在(zai)未來將把SPATAC-seq與單細(xi)胞(bao)蛋(dan)白技術(shu)相結合，進一步驗證(zheng)不同發育(yu)階段中斑馬(ma)魚胚胎cCREs的(de)(de)調節作(zuo)用(yong)。