由于基(ji)因(yin)組(zu)(zu)的(de)高雜(za)(za)合性(xing)(xing)(xing)、自(zi)交(jiao)(jiao)不親(qin)(qin)和(he)性(xing)(xing)(xing)以及長世代等(deng)(deng)(deng)(deng)特性(xing)(xing)(xing)，對于這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)植(zhi)物(wu)(wu)(wu)來說，獲得(de)能夠穩定(ding)遺傳的(de)自(zi)交(jiao)(jiao)系是十(shi)分(fen)困難的(de)。因(yin)此，這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)物(wu)(wu)(wu)種通(tong)常使用異型(xing)雜(za)(za)交(jiao)(jiao)的(de)繁殖方式，以F1代分(fen)離(li)群體(ti)作為主要研(yan)究對象，例如(ru)馬鈴(ling)薯、紅薯、黑麥等(deng)(deng)(deng)(deng)作物(wu)(wu)(wu)，以及蘋果(guo)(guo)、桃、葡萄、柑橘、茶樹(shu)等(deng)(deng)(deng)(deng)果(guo)(guo)樹(shu)。因(yin)為雙(shuang)親(qin)(qin)的(de)高雜(za)(za)合性(xing)(xing)(xing)，對于二倍(bei)體(ti)親(qin)(qin)本，F1代中(zhong)會含有四(si)個單倍(bei)型(xing)。長期以來，基(ji)因(yin)組(zu)(zu)的(de)高雜(za)(za)合性(xing)(xing)(xing)和(he)異型(xing)雜(za)(za)交(jiao)(jiao)一直是分(fen)子育種以及物(wu)(wu)(wu)種改良的(de)主要障(zhang)礙。我們常用的(de)BSA-seq分(fen)析方法（如(ru)?SNP-index, ED等(deng)(deng)(deng)(deng)），對于這(zhe)(zhe)(zhe)種情況就顯(xian)得(de)捉(zhuo)襟(jin)見肘。

在本(ben)研究中(zhong)，作者開發了一套名為OcBSA的(de)(de)分析工具，主要用于解(jie)決在雙親(qin)高度雜合的(de)(de)F1群體中(zhong)進(jin)行QTL定(ding)(ding)位的(de)(de)難題。OcBSA工具通(tong)過關注(zhu)并分析攜帶致病突變的(de)(de)雜合親(qin)本(ben)的(de)(de)兩(liang)個單倍型組的(de)(de)遺傳模式來實(shi)現基(ji)因(yin)定(ding)(ding)位。其(qi)核心(xin)假設是(shi)，這(zhe)兩(liang)個單倍型在兩(liang)個樣本(ben)池(chi)中(zhong)的(de)(de)突變位點會表現出遺傳偏倚，從(cong)而(er)提供定(ding)(ding)位線索(suo)。

相比于其他QTL定(ding)位工具，OcBSA具有明顯的(de)(de)(de)優勢。這一點已經通過計算機(ji)模擬的(de)(de)(de)群體和多個先(xian)前報道的(de)(de)(de)真實雜(za)交群體（包括(kuo)蘋(pin)果、梨(li)、茶樹、葡萄(tao)、桃子、柑橘和水稻(dao)）得到驗證。此(ci)外，OcBSA還(huan)在本研究中(zhong)(zhong)構建的(de)(de)(de)F1代群體中(zhong)(zhong)成(cheng)功應用，識別出(chu)了(le)調控(kong)土豆花色的(de)(de)(de)候選基(ji)因。

OcBSA的算法(fa)與實現

相比于(yu)常(chang)見(jian)的(de)(de)(de)(de)雙(shuang)親(qin)為純合的(de)(de)(de)(de)F2代(dai)(dai)(dai)群(qun)體(ti)(ti)，由(you)異交得(de)到的(de)(de)(de)(de)F1代(dai)(dai)(dai)群(qun)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)雙(shuang)親(qin)通常(chang)顯示出高度雜(za)合性(xing)(xing)。在(zai)顯性(xing)(xing)遺傳(chuan)模型(xing)中(zhong)(zhong)(zhong)，F1代(dai)(dai)(dai)群(qun)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)狀(zhuang)分(fen)(fen)(fen)離是(shi)由(you)于(yu)來(lai)自攜(xie)帶(dai)顯性(xing)(xing)突變(bian)的(de)(de)(de)(de)雜(za)合親(qin)本的(de)(de)(de)(de)兩(liang)個(ge)單(dan)(dan)(dan)(dan)倍(bei)型(xing)在(zai)群(qun)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)發生(sheng)了分(fen)(fen)(fen)離，而另一(yi)個(ge)親(qin)本對性(xing)(xing)狀(zhuang)分(fen)(fen)(fen)離并沒有貢獻。例如，土豆(dou)表皮(pi)顏(yan)色（如圖(tu)1A所示）取決于(yu)親(qin)本P1的(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)(dan)(dan)倍(bei)型(xing)h1中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)突變(bian)。在(zai)F1代(dai)(dai)(dai)中(zhong)(zhong)(zhong)，攜(xie)帶(dai)h1的(de)(de)(de)(de)個(ge)體(ti)(ti)呈(cheng)現紫色，而攜(xie)帶(dai)h2的(de)(de)(de)(de)則呈(cheng)現黃色，且(qie)表皮(pi)顏(yan)色與(yu)親(qin)本P2的(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)(dan)(dan)倍(bei)型(xing)h3和h4無關。在(zai)基(ji)于(yu)目標性(xing)(xing)狀(zhuang)共分(fen)(fen)(fen)離位點(dian)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因型(xing)差異的(de)(de)(de)(de)數據(ju)分(fen)(fen)(fen)析(xi)中(zhong)(zhong)(zhong)（如BSA或連鎖作(zuo)圖(tu)定位），來(lai)自P2的(de)(de)(de)(de)隨機單(dan)(dan)(dan)(dan)倍(bei)型(xing)會引入噪(zao)(zao)音(yin)（如圖(tu)1A中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)橙色峰），這(zhe)會嚴重影響(xiang)基(ji)因型(xing)頻率(lv)的(de)(de)(de)(de)計算，導致目標信號(hao)的(de)(de)(de)(de)偏(pian)差或丟失。在(zai)這(zhe)種情況(kuang)下，當使(shi)用F1代(dai)(dai)(dai)群(qun)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)兩(liang)個(ge)表皮(pi)顏(yan)色差異的(de)(de)(de)(de)混(hun)(hun)池(chi)(chi)(chi)(chi)進(jin)行BSA-seq分(fen)(fen)(fen)析(xi)時，由(you)單(dan)(dan)(dan)(dan)倍(bei)型(xing)h3和h4引入的(de)(de)(de)(de)噪(zao)(zao)音(yin)會大大降(jiang)低QTL定位信號(hao)的(de)(de)(de)(de)敏感(gan)性(xing)(xing)、準(zhun)確性(xing)(xing)和顯著(zhu)性(xing)(xing)。因此(ci)，OcBSA的(de)(de)(de)(de)主(zhu)要策略是(shi)從兩(liang)個(ge)混(hun)(hun)池(chi)(chi)(chi)(chi)中(zhong)(zhong)(zhong)去除h3和h4，創建(jian)兩(liang)個(ge)新(xin)(xin)的(de)(de)(de)(de)混(hun)(hun)池(chi)(chi)(chi)(chi)，即OcPool 1和OcPool 2，這(zhe)兩(liang)個(ge)新(xin)(xin)池(chi)(chi)(chi)(chi)中(zhong)(zhong)(zhong)僅包含h1和h2。這(zhe)些新(xin)(xin)生(sheng)成的(de)(de)(de)(de)虛擬池(chi)(chi)(chi)(chi)OcPool 1和OcPool 2，類似于(yu)使(shi)用親(qin)本P1自交生(sheng)成的(de)(de)(de)(de)F2代(dai)(dai)(dai)群(qun)體(ti)(ti)所構建(jian)的(de)(de)(de)(de)極(ji)端性(xing)(xing)狀(zhuang)混(hun)(hun)池(chi)(chi)(chi)(chi)（圖(tu)1B）。

根據以(yi)上規則，作者(zhe)梳理出了(le)OcBSA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)完整工作流(liu)程。首先，將兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)雜(za)(za)合(he)親(qin)(qin)本(ben)進行雜(za)(za)交，構建F1代群(qun)體，其中(zhong)(zhong)一(yi)個(ge)(ge)親(qin)(qin)本(ben)（P1）攜帶有目標性(xing)狀的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顯性(xing)突變。接著，收(shou)集具(ju)有差(cha)異(yi)(yi)(yi)性(xing)狀的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)F1代個(ge)(ge)體，并將其分(fen)為兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)混(hun)池(chi)(chi)(chi)。然(ran)后，對(dui)這(zhe)(zhe)兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)混(hun)池(chi)(chi)(chi)以(yi)及(ji)兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)親(qin)(qin)本(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)DNA進行全基(ji)(ji)因組(zu)測序。在(zai)(zai)第二步(bu)（如(ru)圖1C所示(shi)(shi)(shi)），將兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)混(hun)池(chi)(chi)(chi)、P1和(he)P2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads比對(dui)到參考基(ji)(ji)因組(zu)上，以(yi)識別SNP（單(dan)核(he)苷酸多態性(xing)）和(he)InDel（插入或缺失變異(yi)(yi)(yi)）。對(dui)于(yu)在(zai)(zai)兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)親(qin)(qin)本(ben)之(zhi)間(jian)存在(zai)(zai)多態性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)SNP和(he)InDel，做進一(yi)步(bu)分(fen)析(xi)(xi)。具(ju)體來說(shuo)，保留(liu)(liu)在(zai)(zai)P1中(zhong)(zhong)為雜(za)(za)合(he)而在(zai)(zai)P2中(zhong)(zhong)為純合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)位點(dian)，以(yi)便進行單(dan)倍(bei)(bei)型(xing)(xing)去除(chu)分(fen)析(xi)(xi)（如(ru)圖1C所示(shi)(shi)(shi)）。此(ci)外，也保留(liu)(liu)在(zai)(zai)P1中(zhong)(zhong)為雜(za)(za)合(he)但在(zai)(zai)P2中(zhong)(zhong)缺失的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)位點(dian)，以(yi)考慮P2中(zhong)(zhong)基(ji)(ji)因組(zu)區域的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺失變異(yi)(yi)(yi)。接下來的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)步(bu)驟(zou)是通(tong)過(guo)去除(chu)P2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)單(dan)倍(bei)(bei)型(xing)(xing)，構建兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)OcPool（如(ru)圖1C和(he)1D所示(shi)(shi)(shi)）。如(ru)圖1C所示(shi)(shi)(shi)，兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)池(chi)(chi)(chi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)黃色框(kuang)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)“m”代表來自P2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)倍(bei)(bei)型(xing)(xing)位點(dian)。作者(zhe)通(tong)過(guo)排(pai)除(chu)覆蓋這(zhe)(zhe)些(xie)P2基(ji)(ji)因型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads來去除(chu)這(zhe)(zhe)些(xie)“m”單(dan)倍(bei)(bei)型(xing)(xing)。從兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)原始混(hun)池(chi)(chi)(chi)中(zhong)(zhong)過(guo)濾掉這(zhe)(zhe)些(xie)reads后，得到兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)OcPool用(yong)于(yu)進一(yi)步(bu)分(fen)析(xi)(xi)。在(zai)(zai)最(zui)后一(yi)步(bu)，作者(zhe)通(tong)過(guo)計算遺傳(chuan)分(fen)化系數(shu)（OcValues），在(zai)(zai)用(yong)戶自定義大小的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)窗口中(zhong)(zhong)滑(hua)動遍(bian)歷整個(ge)(ge)基(ji)(ji)因組(zu)，以(yi)估計兩(liang)(liang)(liang)個(ge)(ge)OcPool中(zhong)(zhong)單(dan)倍(bei)(bei)型(xing)(xing)h1和(he)h2（或l和(he)m）之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)差(cha)異(yi)(yi)(yi)（如(ru)圖1所示(shi)(shi)(shi)）。

圖(tu)1. OcBSA 的原理、方案和工(gong)作流程(cheng)

OcBSA整合(he)多種分析工(gong)(gong)具(ju)（BWA，SAMtools和GATK）,允許用戶在Windows或Linux平臺，使用python腳本(ben)將raw data的fastq格式文件(jian)或vcf文件(jian)作為(wei)輸(shu)入文件(jian)進行(xing)完(wan)整分析。此外，OcBSA集成了批量引物(wu)設計工(gong)(gong)具(ju)，為(wei)用戶之后的精細定位提供便(bian)利。

OcBSA 在使用F1代(dai)群體進行 QTL 定位方(fang)面優于現有工(gong)具

為了(le)展示OcBSA在F1代群體(ti)中的(de)(de)優勢(shi)，作者使(shi)用(yong)QMSim2模擬(ni)生(sheng)成(cheng)了(le)一(yi)個(ge)(ge)包(bao)含1000個(ge)(ge)F1代個(ge)(ge)體(ti)的(de)(de)群體(ti)，全基(ji)因組共有(you)100,000個(ge)(ge)變(bian)異位(wei)點。利用(yong)這個(ge)(ge)模擬(ni)群體(ti)，作者選擇了(le)一(yi)對極端性狀的(de)(de)混池(chi)，每個(ge)(ge)混池(chi)分別包(bao)含20、30和(he)(he)40個(ge)(ge)子代個(ge)(ge)體(ti)，并(bing)進行了(le)600次重復，總共生(sheng)成(cheng)了(le)1800個(ge)(ge)極端性狀混池(chi)。同時，使(shi)用(yong)OcBSA以及(ji)其(qi)他工(gong)具/算法（包(bao)括Ridit、ED、LOD、BSATOS和(he)(he)SNP-index）進行QTL定位(wei)，所有(you)方法使(shi)用(yong)相同的(de)(de)滑動窗口（窗口大小為30 kb，步長(chang)為3 kb）。結(jie)果顯示，OcBSA的(de)(de)表現遠優于其(qi)他對比(bi)工(gong)具，并(bing)且(qie)隨著池(chi)中個(ge)(ge)體(ti)數量的(de)(de)增加，準確性也得到了(le)提高（見圖2）。特別是，從(cong)圖2C和(he)(he)2D中可以看(kan)出，OcBSA展現出了(le)最優的(de)(de)抗噪音(yin)能力。

使用來自不同物種(zhong)的F1代群體(ti)數(shu)據評估OcBSA

除了(le)模擬數(shu)據(ju)，作(zuo)者(zhe)利用已報道的多種不(bu)同(tong)物種的F1代(dai)(dai)群(qun)體(ti)(ti)數(shu)據(ju)，以(yi)檢驗OcBSA的性能(neng)和(he)廣泛(fan)適用性。作(zuo)者(zhe)總共收集了(le)7個(ge)來自(zi)不(bu)同(tong)物種的F1代(dai)(dai)群(qun)體(ti)(ti)數(shu)據(ju)集，包括蘋果(guo)、梨、桃子(zi)、柑橘、葡萄、茶樹(shu)和(he)水(shui)稻。結(jie)果(guo)，OcBSA在所(suo)有(you)7個(ge)數(shu)據(ju)集中均定(ding)位(wei)到QTL，并且結(jie)果(guo)與原報道的結(jie)果(guo)一(yi)致或有(you)提高。

OcBSA有效識別(bie)出馬鈴薯花色調控(kong)位(wei)點

為(wei)了(le)(le)(le)(le)進一(yi)(yi)步驗證OcBSA的(de)(de)有效性，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)構建了(le)(le)(le)(le)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)馬(ma)鈴薯F1代群(qun)體，用于定(ding)(ding)位控制(zhi)馬(ma)鈴薯花色的(de)(de)QTL。研究中，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)將兩個(ge)(ge)(ge)雜合的(de)(de)二倍(bei)體馬(ma)鈴薯材料(liao)（一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)為(wei)紫花，另一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)為(wei)黃(huang)花）進行(xing)雜交，構建了(le)(le)(le)(le)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)包含252個(ge)(ge)(ge)單株(zhu)的(de)(de)F1代群(qun)體。性狀(zhuang)調查結果顯(xian)示，F1代群(qun)體中紫花（132株(zhu)）與黃(huang)花（120株(zhu)）的(de)(de)比(bi)例(li)約(yue)為(wei)1:1（χ2 = 0.48, P = 0.45），表明花色性狀(zhuang)由單基(ji)因控制(zhi)。接下(xia)(xia)來，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)分別(bie)選擇了(le)(le)(le)(le)30株(zhu)紫花單株(zhu)和(he)(he)29株(zhu)黃(huang)花單株(zhu)，進行(xing)混池測(ce)(ce)序(xu)，分別(bie)獲得了(le)(le)(le)(le)61.84 Gb和(he)(he)64.39 Gb（約(yue)70×）的(de)(de)重測(ce)(ce)序(xu)數據。同時(shi)，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)對雙親也進行(xing)了(le)(le)(le)(le)重測(ce)(ce)序(xu)，分別(bie)生成了(le)(le)(le)(le)約(yue)15×的(de)(de)重測(ce)(ce)序(xu)數據。通過與參考(kao)基(ji)因組（DM8.1）進行(xing)比(bi)對分析(xi)，共(gong)鑒定(ding)(ding)出28,141,212個(ge)(ge)(ge)SNP和(he)(he)3,764,490個(ge)(ge)(ge)indel。接下(xia)(xia)來，作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)(zhe)將利用OcBSA對這(zhe)些(xie)數據進行(xing)QTL定(ding)(ding)位。

結(jie)果(guo)顯(xian)示，OcValue超(chao)過top 0.1%的(de)(de)(de)峰(feng)值位(wei)點落在第10號(hao)染色體(ti)的(de)(de)(de)53.7 Mb區(qu)域(yu)，區(qu)間(jian)(jian)范圍為53.4–53.9 Mb，表明(ming)該(gai)位(wei)置存在QTL。為驗證(zheng)該(gai)QTL位(wei)點，作(zuo)者在45.7到(dao)56.7 Mb的(de)(de)(de)區(qu)間(jian)(jian)內(nei)設計(ji)了(le)14個(ge)indel標記，并在兩(liang)個(ge)混池樣本中(zhong)進(jin)行了(le)基(ji)因分(fen)型(xing)（圖4B）。結(jie)果(guo)顯(xian)示，indel分(fen)型(xing)結(jie)果(guo)與(yu)OcBSA定位(wei)結(jie)果(guo)完全一致。進(jin)一步分(fen)析9個(ge)關鍵重組單株后，作(zuo)者將(jiang)定位(wei)區(qu)間(jian)(jian)縮小至約740 kb（圖4C），該(gai)區(qu)域(yu)包含48個(ge)基(ji)因。這一區(qu)域(yu)與(yu)前人報道的(de)(de)(de)花青(qing)素合成相關的(de)(de)(de)QTL區(qu)域(yu)重合，并且另一項研究通(tong)過轉基(ji)因驗證(zheng)發現，該(gai)區(qu)域(yu)的(de)(de)(de)ANTHOCYANIN 2基(ji)因負責控制馬鈴薯紫花性狀。這一結(jie)果(guo)再次證(zheng)明(ming)了(le)OcBSA在F1異(yi)交群體(ti)QTL定位(wei)中(zhong)的(de)(de)(de)準確性和有效性。

作(zuo)者通(tong)過利用(yong)模擬F1代(dai)(dai)群(qun)體數據(ju)，將(jiang)OcBSA與其他(ta)BSA-seq分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)算(suan)法和(he)工(gong)具(ju)的(de)(de)QTL定位結(jie)果進行對(dui)比，結(jie)果顯(xian)示，OcBSA的(de)(de)表現顯(xian)著優(you)于(yu)其他(ta)分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)算(suan)法和(he)工(gong)具(ju)。隨(sui)后(hou)，作(zuo)者使用(yong)OcBSA重(zhong)新分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)了(le)已報道的(de)(de)不同物種(zhong)(zhong)的(de)(de)F1代(dai)(dai)數據(ju)集，得到了(le)與原報道一致或更優(you)的(de)(de)結(jie)果。最后(hou)，作(zuo)者將(jiang)OcBSA應用(yong)于(yu)馬鈴薯(shu)花(hua)色QTL定位的(de)(de)研究中(zhong)，成功(gong)定位到前(qian)人報道的(de)(de)相(xiang)關區間及基因。這些結(jie)果表明，OcBSA在F1代(dai)(dai)異交群(qun)體的(de)(de)QTL定位研究中(zhong)具(ju)有(you)高(gao)度的(de)(de)準確(que)性和(he)有(you)效性，為(wei)后(hou)續(xu)的(de)(de)育種(zhong)(zhong)工(gong)作(zuo)提供了(le)重(zhong)要的(de)(de)支持和(he)幫助(zhu)。

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