2024-09-18
當我們(men)做完轉錄(lu)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)之(zhi)后，往往需要做qPCR來驗證測(ce)(ce)序(xu)結(jie)(jie)果。這種情況下，基因(yin)的(de)選擇、樣品的(de)情況都是(shi)成為影響(xiang)結(jie)(jie)果的(de)重要因(yin)素。今天(tian)就讓(rang)小派來帶大家深挖(wa)下這其中的(de)門道吧！
一、驗證基因的(de)選(xuan)擇 1、選擇自己(ji)感興趣的(de)基因進(jin)行驗證，即使其(qi)表達倍(bei)數可能沒有到(dao)達2倍(bei)（比如1.5倍(bei)）； 2、選擇表(biao)達(da)量變化幅度較大的基因，比如差異倍數(shu)大于兩倍（即fc>2或(huo)<0.5）； 3、選擇具有統計學差(cha)異(yi)的基(ji)因，比(bi)如(ru)pvalue<0.05甚(shen)至(zhi)qvalue<0.05（另(ling)外如(ru)果樣本類型異(yi)質性較高且在進行(xing)測(ce)序時生(sheng)物學重復數偏低情(qing)況下(xia)，即使p值大于(yu)0.05，在其表達(da)量尚(shang)可且變化幅度尚(shang)可的情(qing)況下(xia)也是可以考慮的）； 4、選擇表達(da)量比(bi)較高的基(ji)(ji)因，在比(bi)較的樣(yang)本組(zu)中(zhong)，至少有一組(zu)樣(yang)本的基(ji)(ji)因表達(da)豐度（FPKM值(zhi)）平均值(zhi)大于10（不是絕對(dui)標準）； 5、建議選擇生(sheng)物學(xue)重復樣本(ben)間一(yi)致(zhi)性較高的基因（對(dui)于異(yi)(yi)質性較高的樣本(ben)，基因在生(sheng)物學(xue)重復樣本(ben)間可能也有明顯差異(yi)(yi)，但(dan)差異(yi)(yi)倍數(shu)是(shi)實驗組和對(dui)照(zhao)組表達量平均值相除，一(yi)些(xie)異(yi)(yi)常表達量可能對(dui)差異(yi)(yi)倍數(shu)產生(sheng)影響）； 6、盡(jin)量選擇(ze)多(duo)一些基因（15-30個）進行驗證(zheng)，看總體差(cha)異(yi)趨勢情況。
二、轉錄組和qPCR一致性 首(shou)先，我們需(xu)要對轉(zhuan)錄組和(he)qPCR一(yi)(yi)致性有一(yi)(yi)個(ge)合理預期：這兩個(ge)實驗方法本(ben)身存在(zai)差(cha)異，因此存在(zai)一(yi)(yi)定程度的(de)(de)不一(yi)(yi)致性（約(yue)30-40%）是正常的(de)(de)情況(kuang)[1]。在(zai)Huang J等人的(de)(de)研(yan)究中(zhong)，出現(xian)轉(zhuan)錄組和(he)qPCR結果的(de)(de)不一(yi)(yi)樣（甚至趨勢(shi)相(xiang)反的(de)(de)情況(kuang)），文章也對這種情況(kuang)進行了探(tan)討[2]。 因(yin)此在這里小派總(zong)結(jie)了幾個可能影響轉錄(lu)組(zu)和qPCR一(yi)致性(xing)的原因(yin)： 1、樣本是否為同一批次： 因(yin)為RNA的(de)(de)(de)表(biao)達具(ju)有時空特異(yi)性，不同批次處(chu)理的(de)(de)(de)樣(yang)本之間本身可能存(cun)在一定的(de)(de)(de)差(cha)異(yi)，所以(yi)做qPCR驗證的(de)(de)(de)時候建議是直接(jie)用轉(zhuan)錄組測(ce)序返樣(yang)的(de)(de)(de)RNA。并且當我們在轉(zhuan)錄組測(ce)序中發現(xian)非(fei)常明顯的(de)(de)(de)離群樣(yang)本時候，避免(mian)這種個體特異(yi)性導致結(jie)果不準確，可以(yi)在做轉(zhuan)錄組分析和后續驗證時候剔除(chu)這種離群樣(yang)本。 2、比較組順序是否反了(le)： 在(zai)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)分(fen)析(xi)中，文章中普(pu)遍(bian)存(cun)在(zai)兩(liang)種不(bu)同的比(bi)較組(zu)(zu)(zu)命(ming)名(ming)方(fang)法，即 對(dui)(dui)照組(zu)(zu)(zu) vs 處理(li)組(zu)(zu)(zu)、處理(li)組(zu)(zu)(zu) vs 對(dui)(dui)照組(zu)(zu)(zu)，在(zai)分(fen)析(xi)差異的時(shi)候都是(shi)用(yong) 處理(li)組(zu)(zu)(zu)/對(dui)(dui)照組(zu)(zu)(zu) 的。這兩(liang)種命(ming)名(ming)上存(cun)在(zai)差異，可能是(shi)會導致(zhi)差異的理(li)解存(cun)在(zai)不(bu)同情況，在(zai)小派這里轉(zhuan)錄組(zu)(zu)(zu)項目的命(ming)名(ming)都是(shi) 對(dui)(dui)照組(zu)(zu)(zu) vs 處理(li)組(zu)(zu)(zu)。 3、qPCR操作(zuo)是否規范： qPCR儀(yi)器的(de)靈(ling)敏度不(bu)僅取決于儀(yi)器本身(shen)的(de)技術規格，還受到實驗操(cao)作(zuo)規范性的(de)影響。設置(zhi)預實驗，通過擴增曲(qu)線和溶(rong)解(jie)曲(qu)線來判斷引物是(shi)否(fou)合適，是(shi)非常重要的(de)步驟(zou)；并(bing)且在正式(shi)實驗中，重復的(de)設置(zhi)也是(shi)不(bu)可缺少的(de)一環。 4、引物設計是否合理： 在真核生(sheng)物(wu)中，基因(yin)可能(neng)(neng)(neng)通過不同的(de)剪切(qie)形式產生(sheng)多條轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)(ben)，而(er)各(ge)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)(ben)的(de)差異變化(hua)趨勢也(ye)可能(neng)(neng)(neng)是(shi)不一致的(de)，因(yin)此(ci)我們需要明確我們做qPCR是(shi)針對(dui)(dui)基因(yin)還是(shi)針對(dui)(dui)特定的(de)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)(ben)去(qu)驗證(zheng)。常(chang)規轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)分析(xi)是(shi)針對(dui)(dui)于整(zheng)個基因(yin)定量的(de)，因(yin)此(ci)可以(yi)針對(dui)(dui)多個轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)(ben)共有的(de)外(wai)顯(xian)(xian)子去(qu)設(she)(she)計(ji)(ji)引(yin)物(wu)，從而(er)驗證(zheng)基因(yin)的(de)表(biao)達；如果是(shi)對(dui)(dui)特定轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)(ben)分析(xi)的(de)話，可能(neng)(neng)(neng)需要找到整(zheng)個轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)(ben)特有的(de)外(wai)顯(xian)(xian)子部分設(she)(she)計(ji)(ji)引(yin)物(wu)驗證(zheng)。另一方面，設(she)(she)計(ji)(ji)完(wan)引(yin)物(wu)后，可以(yi)通過NCBI的(de)Primer blast去(qu)看(kan)看(kan)設(she)(she)計(ji)(ji)的(de)引(yin)物(wu)是(shi)否在基因(yin)組(zu)里是(shi)特異性擴增(zeng)的(de)。 5、基因選擇是否合(he)適(shi)： 驗證的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)一(yi)般建議選擇表(biao)達豐度較高的(de)，因(yin)(yin)(yin)為對(dui)(dui)于表(biao)達豐度非(fei)常低的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)來(lai)說，本(ben)身測序和qPCR對(dui)(dui)其的(de)定量就不(bu)一(yi)定非(fei)常可靠。另外對(dui)(dui)于基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組相(xiang)同位置存(cun)在多個(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)（例如相(xiang)同位置存(cun)在正(zheng)負2個(ge)方向的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)）或在基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組中(zhong)存(cun)在多拷貝(bei)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，也并不(bu)建議選擇去驗證。選擇的(de)內參基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)在不(bu)同樣品里是(shi)否穩(wen)定表(biao)達，是(shi)另一(yi)個(ge)影(ying)響qPCR相(xiang)對(dui)(dui)定量結果的(de)關鍵因(yin)(yin)(yin)素。 6、兩(liang)種技術本身存(cun)在差異： 轉錄組(zu)測序是(shi)基(ji)(ji)于(yu)檢(jian)測樣品里所(suo)有基(ji)(ji)因整體上的(de)(de)表達情(qing)況，qPCR是(shi)特異性設(she)計引物對基(ji)(ji)因的(de)(de)局(ju)部區域做相對定(ding)量的(de)(de)，兩者的(de)(de)技(ji)術原理是(shi)存(cun)在一定(ding)不同的(de)(de)，所(suo)以轉錄組(zu)和qPCR確實有可能存(cun)在并(bing)沒有非常一致(zhi)的(de)(de)情(qing)況的(de)(de)，一般來說主要看大部分基(ji)(ji)因的(de)(de)趨(qu)勢(shi)一致(zhi)就(jiu)行的(de)(de)。 備注（一種比(bi)較特別的(de)情(qing)況(kuang)）： 為什么敲除(chu)基因A的(de)2號外(wai)顯子后(hou)，K組的(de)表達比WT組還高了？ qPCR驗(yan)證的(de)時候一(yi)般是(shi)針對(dui)敲(qiao)(qiao)除部(bu)分去檢測，所以能(neng)很好(hao)的(de)驗(yan)證敲(qiao)(qiao)除情況(kuang)。而(er)常規轉(zhuan)錄組是(shi)對(dui)整個(ge)基因(yin)定(ding)量的(de)，雖(sui)然敲(qiao)(qiao)除了(le)2號外(wai)顯(xian)子(zi)，但(dan)其(qi)它(ta)外(wai)顯(xian)子(zi)的(de)轉(zhuan)錄層(ceng)面可能(neng)并(bing)沒有受到限制，并(bing)且由于劑量效應的(de)影(ying)響(xiang)，敲(qiao)(qiao)除了(le)2號外(wai)顯(xian)子(zi)后，可能(neng)刺激了(le)其(qi)它(ta)外(wai)顯(xian)子(zi)的(de)表達，因(yin)此從轉(zhuan)錄組測序的(de)結(jie)果來看可能(neng)就出來了(le)敲(qiao)(qiao)除組的(de)這個(ge)基因(yin)表達甚至相(xiang)比對(dui)照(zhao)上升了(le)。 雖然是(shi)從轉錄組測序來看這個表達(da)沒有下調，但(dan)是(shi)敲(qiao)除后，翻(fan)譯成蛋白(bai)可能受到阻礙，因此結合qPCR的(de)驗(yan)證和(he)IGV圖，是(shi)可以(yi)充分(fen)表明敲(qiao)除是(shi)沒問(wen)題的(de)哈。 IGV是使用可以參考教程：//mp.weixin.qq.com/s/7-_l5aQ72p8vvk2Ot4gfZg
三、轉錄組和qPCR結果可(ke)視(shi)化 做完qPCR后，我(wo)們會(hui)得到(dao)基(ji)因在樣(yang)品里的相(xiang)對定量結(jie)果（一般使(shi)用(yong)2-??Ct），而(er)在轉錄組中也(ye)有這些基(ji)因log2fc結(jie)果，如下： 針對于這(zhe)兩個數據的展示，通常有以下幾種圖： 1、柱狀圖： a.基于qPCR的相對定量(liang)結果，引(yin)用excel的函數(shu)（log、average、stdev）求得log2fc和(he)標(biao)準差； b.將qPCR和轉(zhuan)錄組的(de)數據整理(li)（qPCR和RNA-seq的(de)log2fc、qPCR的(de)標準差）成表； C.基于前(qian)3列用(yong)excel繪制柱狀(zhuang)圖，然后添加qPCR的誤差(cha)線（自定義設置(zhi)：±標準(zhun)差(cha)）。 2、柱狀圖(tu)+折現圖(tu)： a.基于(yu)1b里整理完(wan)的(de)數據(ju)，在(zai)excel里插入組合圖； B.給柱(zhu)狀圖增加誤(wu)差線(xian)，調整(zheng)下，出(chu)圖。 3、散點圖（針對(dui)多比較(jiao)組的結果，展(zhan)示的更方(fang)便）： a.基于(yu)1a里計算(suan)的(de)qPCA的(de)log2fc結果(guo)，與轉錄組的(de)log2fc結果(guo)一一對應(ying)的(de)整理數據(ju)； b.選中2列log2fc結果，用excel繪制(zhi)散(san)點圖，添加(jia)趨勢(shi)線(xian)（可以顯示公(gong)式和R平方）。
[1]Chen X, Yang X, Xie J, Ding W, Li Y, Yue Y, Wang L. Biochemical and Comparative Transcriptome Analyses Reveal Key Genes Involved in Major Metabolic Regulation Related to Colored Leaf Formation in Osmanthus fragrans 'Yinbi Shuanghui' during Development. Biomolecules. 2020 Apr 4;10(4):549. [2]Huang J, Zhou Q. Gene Biomarkers Related to Th17 Cells in Macular Edema of Diabetic Retinopathy: Cutting-Edge Comprehensive Bioinformatics Analysis and In Vivo Validation. Front Immunol. 2022 May 16;13:858972.
