2024-09-18
DNA復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)是一個(ge)關(guan)鍵的(de)(de)(de)生(sheng)物學過(guo)程。在人(ren)類細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)，成千上萬的(de)(de)(de)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)叉協同(tong)進行基(ji)因組的(de)(de)(de)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。這一過(guo)程的(de)(de)(de)速率可能(neng)受(shou)基(ji)因組表觀遺(yi)傳(chuan)狀態的(de)(de)(de)影響，并(bing)且在不同(tong)細(xi)胞(bao)(bao)類型之間(jian)(jian)，甚至(zhi)同(tong)一細(xi)胞(bao)(bao)類型內部也會有所變化。基(ji)因組必須被準確(que)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，以(yi)避免發育缺陷和腫(zhong)瘤(liu)等問題。遺(yi)傳(chuan)學和生(sheng)物化學研究揭示(shi)了許多DNA復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)因子及其相(xiang)互(hu)作用(yong)，這些因子確(que)保了基(ji)因組的(de)(de)(de)高保真復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。為全面探測DNA復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)過(guo)程，DNA測序技(ji)術被用(yong)于闡明復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)動態特(te)征，如復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)時間(jian)(jian)、復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)叉的(de)(de)(de)方向性、起始(shi)點(dian)以(yi)及DNA聚合酶的(de)(de)(de)使用(yong)。此外，單(dan)分(fen)子方法也被廣泛應用(yong)于監測單(dan)個(ge)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)叉的(de)(de)(de)行為，包(bao)括復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)速度(du)和分(fen)叉失速現(xian)象(xiang)。這些方法通(tong)過(guo)顯微鏡或長讀測序進行觀察(cha)，但由(you)于它們(men)通(tong)常從(cong)大量細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)隨機取樣，因此對(dui)單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)之間(jian)(jian)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)動力(li)學的(de)(de)(de)差異較為不敏感。 2024年(nian)6月(yue)，Hubrecht研究(jiu)(jiu)所的(de)Jeroen van den Berg和Alexander van Oudenaarden以共同通訊作者身份在(zai)Nature Methods上發(fa)表了題為“Quantifying DNA replication speeds in single cells by scEdU-seq”的(de)研究(jiu)(jiu)論文，介紹了一(yi)種檢測DNA復制速度的(de)單細胞測序(xu)技術——單細胞5-乙炔(gui)基(ji)-2 ′-脫氧尿苷測序(xu)（scEdU-seq）。
scEdU-seq技術(shu)概述及用于揭示S期DNA復制譜
為(wei)了(le)測(ce)量DNA復制叉動(dong)力(li)學的(de)異質(zhi)性(xing)，作者開發了(le)scEdU-seq技(ji)術，這是(shi)一種在單個細(xi)胞中鑒定復制新(xin)生(sheng)DNA的(de)測(ce)序(xu)方法。scEdU-seq技(ji)術利(li)用了(le)核苷酸(suan)類似物(wu)5-乙(yi)基-2'-脫(tuo)氧尿苷（EdU）的(de)代謝標(biao)記(ji)和新(xin)合成DNA片段(duan)的(de)親(qin)和力(li)捕獲。此外，scEdU-seq還能同(tong)時(shi)分析新(xin)生(sheng)DNA和非新(xin)生(sheng)DNA。 具(ju)體操(cao)作中(zhong)，首先通過(guo)銅(I)催化(hua)的(de)(de)(de)疊氮化(hua)物-炔(gui)環(huan)加成點擊化(hua)學，將生物素(su)部分(fen)共價連接(jie)到(dao)尿(niao)嘧(mi)啶堿基。點擊反應(ying)后(hou)，將單個細胞分(fen)選到(dao)384孔(kong)板中(zhong)進行處(chu)理。接(jie)著，使用限(xian)制性(xing)(xing)內切酶（Nla III）和末端修(xiu)復酶（如大Klenow片段和多核苷酸激酶）消化(hua)單細胞基因組(zu)，將生成的(de)(de)(de)片段連接(jie)到(dao)包含適配器(qi)、細胞特異性(xing)(xing)條(tiao)形碼(ma)和獨特分(fen)子標識符(fu)（UMI）的(de)(de)(de)連接(jie)體上。細胞池(chi)合并(bing)后(hou)，通過(guo)生物素(su)捕(bu)獲(huo)含有(you)EdU的(de)(de)(de)DNA分(fen)子，并(bing)通過(guo)熱變性(xing)(xing)釋放非EdU修(xiu)飾的(de)(de)(de)鏈。隨后(hou)，通過(guo)Klenow介導的(de)(de)(de)引物延伸和T7依賴性(xing)(xing)轉(zhuan)錄進行線性(xing)(xing)擴增。最(zui)后(hou)，將線性(xing)(xing)擴增的(de)(de)(de)RNA通過(guo)逆轉(zhuan)錄（RT）轉(zhuan)化(hua)為互補(bu)DNA，并(bing)用聚合酶鏈反應(ying)（PCR）進行擴增，最(zui)后(hou)便可準備進行Illumina測序。 研究人(ren)員在(zai)(zai)表達人(ren)端(duan)粒酶逆轉(zhuan)錄酶（hTERT）的(de)(de)RPE-1細胞(bao)中(zhong)比較了scEdU-seq和Repli-Seq技術，發現兩(liang)者(zhe)獲得的(de)(de)DNA復制譜(pu)有大量(liang)重疊（見圖1b）。scEdU-seq的(de)(de)一個(ge)特點是能夠(gou)同(tong)時分(fen)析(xi)新生DNA和非新生DNA，并(bing)觀(guan)察到同(tong)一樣本中(zhong)，新生DNA和非新生DNA之間存在(zai)(zai)反(fan)相關性。隨后，研究人(ren)員使用FACS富集S期細胞(bao)，并(bing)進(jin)行(xing)15分(fen)鐘的(de)(de)EdU標記。通過對(dui)(dui)單個(ge)細胞(bao)的(de)(de)scEdU-seq信(xin)號(hao)進(jin)行(xing)分(fen)析(xi)，并(bing)依據細胞(bao)的(de)(de)復制時間對(dui)(dui)其(qi)進(jin)行(xing)排序，成功重建(jian)了S期進(jin)展。結果顯示，基(ji)于scEdU-seq的(de)(de)S期進(jin)展能準確反(fan)映細胞(bao)周期的(de)(de)位(wei)置，表明該方法可以用來對(dui)(dui)細胞(bao)進(jin)行(xing)排序。 為了實現對單細(xi)胞(bao)S期進程的(de)(de)排序，作者從(cong)1,343個(ge)RPE-1 hTERT FUCCI細(xi)胞(bao)中(zhong)構(gou)建了完(wan)整的(de)(de)S期DNA復(fu)(fu)制(zhi)軌(gui)跡(ji)（見圖1f）。觀察(cha)到scEdU-seq軌(gui)跡(ji)的(de)(de)早期S期進展與(yu)EdU-seq-HU鑒定(ding)的(de)(de)DNA復(fu)(fu)制(zhi)起始區位置重(zhong)疊。研究人員通過擬合(he)每(mei)個(ge)細(xi)胞(bao)的(de)(de)隱馬爾(er)可夫模型(xing)（HMM），識(shi)別了由(you)相(xiang)同復(fu)(fu)制(zhi)體產生的(de)(de)復(fu)(fu)制(zhi)延伸，發(fa)現每(mei)個(ge)RPE-1細(xi)胞(bao)中(zhong)約有(you)4,500個(ge)復(fu)(fu)制(zhi)叉（見圖1g），并(bing)且單條染色(se)體在S期的(de)(de)DNA復(fu)(fu)制(zhi)叉數遵(zun)循相(xiang)似的(de)(de)趨勢(shi)。靈敏(min)度比較測(ce)試(shi)表明，scEdU-seq能檢測(ce)到scRepli-Seq未能發(fa)現或檢測(ce)較少(shao)的(de)(de)DNA復(fu)(fu)制(zhi)叉。 圖(tu)1. ScEdU-seq揭示了整(zheng)個(ge)S期的有(you)序DNA復制譜
雙脈沖scEdU-seq評(ping)估DNA復制(zhi)速度
研(yan)(yan)究(jiu)人員采取雙(shuang)脈(mo)沖(chong)EdU標記(ji)(ji)策(ce)略檢測單(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)DNA復(fu)制(zhi)速度。雙(shuang)脈(mo)沖(chong)EdU標記(ji)(ji)策(ce)略導致單(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)復(fu)制(zhi)速度的(de)(de)準確性增加，并且對每(mei)個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)恢復(fu)的(de)(de)唯一讀取不太敏(min)感(gan)。在(zai)(zai)接受兩個(ge)EdU脈(mo)沖(chong)后，處于S期的(de)(de)單(dan)(dan)個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)基因組被(bei)間隔一定距(ju)離的(de)(de)EdU片段(duan)修飾。暴露于單(dan)(dan)個(ge)EdU脈(mo)沖(chong)的(de)(de)單(dan)(dan)個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)在(zai)(zai)Δx= 0時有(you)最(zui)大(da)值(zhi)(圖(tu)2b)；暴露于雙(shuang)EdU脈(mo)沖(chong)(Δt = 45, 75或(huo)105 min)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)顯(xian)示第(di)二個(ge)最(zui)大(da)值(zhi)。隨著Δt的(de)(de)增加，第(di)二個(ge)最(zui)大(da)值(zhi)會向更大(da)的(de)(de)Δx值(zhi)偏(pian)移(圖(tu)2b)。研(yan)(yan)究(jiu)人員發現(xian)單(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)間DNA復(fu)制(zhi)速度差異(yi)很大(da)（~1.5倍差異(yi)，圖(tu)2c, d），這種差異(yi)極(ji)大(da)程度上與單(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)在(zai)(zai)S期的(de)(de)位置(zhi)有(you)關。 圖2. 雙脈(mo)沖scEdU-seq允許評估(gu)DNA復制速(su)度(du)
轉錄限制(zhi)了早期S期DNA的復(fu)制(zhi)速度(du)
通過雙EdU脈沖結合(he)混合(he)模型，研(yan)究人(ren)員測量了(le)單細胞(bao)(bao)(bao)內DNA的(de)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)速(su)度(du)。結果(guo)顯(xian)示，單個(ge)細胞(bao)(bao)(bao)之間的(de)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)速(su)度(du)差異約(yue)為1.5倍。總(zong)體上，DNA復(fu)(fu)(fu)制(zhi)速(su)度(du)在S期(qi)穩步增(zeng)加，表明(ming)整個(ge)S期(qi)的(de)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)速(su)度(du)加快（見圖3b）。這一觀(guan)(guan)察結果(guo)通過對(dui)分選(xuan)的(de)早期(qi)和晚期(qi)S期(qi)RPE-1 hTERT細胞(bao)(bao)(bao)的(de)DNA纖維分析得到(dao)確認。同時，類(lei)(lei)似的(de)S期(qi)復(fu)(fu)(fu)制(zhi)速(su)度(du)增(zeng)加現(xian)象也(ye)在誘導的(de)多能干細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)被觀(guan)(guan)察到(dao)。在人(ren)類(lei)(lei)細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)，尚未(wei)觀(guan)(guan)察到(dao)整個(ge)S期(qi)DNA復(fu)(fu)(fu)制(zhi)速(su)度(du)的(de)加速(su)，而S期(qi)早期(qi)DNA復(fu)(fu)(fu)制(zhi)速(su)度(du)降低的(de)機制(zhi)仍不明(ming)確。 先(xian)前的(de)(de)研(yan)究表(biao)明，早(zao)期(qi)復(fu)制(zhi)的(de)(de)DNA通(tong)常靠近活躍的(de)(de)轉錄(lu)(lu)區(qu)域(yu)。為(wei)了量化S期(qi)的(de)(de)轉錄(lu)(lu)水(shui)平，研(yan)究人員(yuan)使(shi)用了RPE-1細胞的(de)(de)單細胞新生RNA測(ce)序數據(ju)。結果顯(xian)示，基因(yin)組中與(yu)scEdU-seq信號重疊的(de)(de)區(qu)域(yu)在S期(qi)初期(qi)的(de)(de)轉錄(lu)(lu)水(shui)平最高(gao)（見圖(tu)3e、f）。此外，隨著DNA復(fu)制(zhi)進入S期(qi)，轉錄(lu)(lu)區(qu)域(yu)的(de)(de)數量和轉錄(lu)(lu)水(shui)平逐漸下降。早(zao)期(qi)S期(qi)的(de)(de)高(gao)轉錄(lu)(lu)水(shui)平與(yu)較(jiao)低的(de)(de)DNA復(fu)制(zhi)速(su)度(du)相關（見圖(tu)3e、f）。實際上(shang)，S期(qi)早(zao)期(qi)的(de)(de)轉錄(lu)(lu)區(qu)域(yu)比非(fei)轉錄(lu)(lu)區(qu)域(yu)復(fu)制(zhi)速(su)度(du)更(geng)慢（見圖(tu)3e），這表(biao)明轉錄(lu)(lu)活動(dong)限制(zhi)了S期(qi)早(zao)期(qi)的(de)(de)DNA復(fu)制(zhi)速(su)度(du)。 圖3 早期(qi)(qi)S期(qi)(qi)DNA的復制速度受到(dao)轉錄限制
轉(zhuan)錄偶聯損傷(shang)降低DNA復制速度?
為(wei)了評(ping)估(gu)未激(ji)活(huo)(huo)RNAPII轉錄(lu)對DNA復制(zhi)(zhi)(zhi)速(su)度(du)(du)的(de)影響(xiang)，研究人員在兩個EdU脈沖之間使用轉錄(lu)抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑5,6-二氯苯(ben)并咪唑-1-β-d-核(he)糖呋喃苷處理(li)(li)細胞，此(ci)處理(li)(li)不會改變復制(zhi)(zhi)(zhi)起(qi)始區(qu)或時(shi)間。結果(guo)顯示(shi)(shi)，抑制(zhi)(zhi)(zhi)RNAPII的(de)細胞相(xiang)比于接受二甲(jia)基亞砜處理(li)(li)的(de)對照組(zu)，DNA復制(zhi)(zhi)(zhi)速(su)度(du)(du)總體(ti)上有所增加。進一(yi)步的(de)實驗通過流(liu)式(shi)細胞術和PARP-1過表達顯示(shi)(shi)，S期(qi)的(de)DNA復制(zhi)(zhi)(zhi)速(su)度(du)(du)加快。研究發現，RNAPII轉錄(lu)及其引(yin)發的(de)DNA損傷在S期(qi)早期(qi)限制(zhi)(zhi)(zhi)了復制(zhi)(zhi)(zhi)速(su)度(du)(du)，而PARP活(huo)(huo)性在調節響(xiang)應(ying)轉錄(lu)相(xiang)關(guan)DNA損傷的(de)DNA復制(zhi)(zhi)(zhi)速(su)度(du)(du)方面起(qi)著關(guan)鍵作(zuo)用。 圖4 轉錄(lu)偶聯損傷(shang)降低DNA復制(zhi)速度
總結(jie)
綜上所述，研(yan)究團隊開(kai)發(fa)了一種單細胞(bao)測(ce)序技術(shu)——scEdU-seq用于分析單細胞(bao)DNA復(fu)(fu)制速(su)(su)度。基于該技術(shu)揭(jie)示(shi)了S期DNA復(fu)(fu)制速(su)(su)度的加速(su)(su)現象，并發(fa)現轉錄相關的DNA損傷通過增加PARP活性來降(jiang)低DNA復(fu)(fu)制速(su)(su)度。該技術(shu)不僅具備(bei)低成本的優勢，同時無(wu)需進行拷(kao)貝校正。盡管存在一些(xie)技術(shu)限制，scEdU-seq有望在多種生物(wu)系統中有效研(yan)究單細胞(bao)DNA的復(fu)(fu)制動力(li)學和復(fu)(fu)制速(su)(su)度。
