世界上沒有兩片相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)樹葉，對(dui)于(yu)細(xi)胞來說也是一樣。細(xi)胞與(yu)(yu)細(xi)胞之(zhi)間也存在(zai)著異(yi)(yi)質性。這(zhe)種(zhong)異(yi)(yi)質性不僅體(ti)現(xian)(xian)在(zai)宏觀形(xing)態上，比(bi)如(ru)相(xiang)同(tong)組(zu)織(zhi)中(zhong)細(xi)胞的(de)(de)(de)類型(xing)，狀態和相(xiang)互作用差異(yi)(yi)；也體(ti)現(xian)(xian)在(zai)遺傳(chuan)信(xin)息上，比(bi)如(ru)基(ji)因組(zu)信(xin)息及基(ji)因表達(da)水平等差異(yi)(yi)。傳(chuan)統的(de)(de)(de)轉錄(lu)組(zu)分析是使用批量RNA測序(xu)（bulk RNA-seq）進行(xing)的(de)(de)(de)，測量的(de)(de)(de)是細(xi)胞基(ji)因表達(da)水平的(de)(de)(de)平均值，非常容易丟失細(xi)胞異(yi)(yi)質性的(de)(de)(de)信(xin)息，而(er)單細(xi)胞轉錄(lu)組(zu)測序(xu)（scRNA seq）可以捕獲單個細(xi)胞內(nei)的(de)(de)(de)mRNA，就(jiu)可以發(fa)現(xian)(xian)不同(tong)細(xi)胞之(zhi)間的(de)(de)(de)異(yi)(yi)質性與(yu)(yu)小群(qun)體(ti)細(xi)胞的(de)(de)(de)重要(yao)功能，彌補了bulk RNA-seq的(de)(de)(de)局限性。

 單細胞與傳統(tong)轉錄組測序(xu)對比

近年來(lai)(lai)，單細(xi)胞(bao)轉錄組測(ce)序(xu)已(yi)經成為生命(ming)科(ke)(ke)學(xue)領域最(zui)火的(de)測(ce)序(xu)技術，越來(lai)(lai)越受到(dao)科(ke)(ke)研工作(zuo)者們(men)(men)的(de)青睞。與此同時，單細(xi)胞(bao)產品(pin)的(de)種類也(ye)越來(lai)(lai)越多，為廣大科(ke)(ke)研工作(zuo)者們(men)(men)的(de)學(xue)術研究帶來(lai)(lai)了更多的(de)便利與可能性，但琳瑯滿目的(de)產品(pin)也(ye)讓(rang)科(ke)(ke)研工作(zuo)者們(men)(men)不知該如何(he)選(xuan)擇。

基于此，派森諾提供4種單(dan)細胞轉錄組(zu)測(ce)序和4種空間轉錄組(zu)測(ce)序產品供大家(jia)選擇，涵蓋(gai)了各(ge)種主流單(dan)細胞測(ce)序，滿(man)足了不同(tong)客(ke)戶(hu)的不同(tong)測(ce)序需求。

派森諾單細胞空轉(zhuan)技(ji)術(shu)平臺

那我們應該如何根據自己(ji)的需求在這些(xie)單細胞、空轉(zhuan)產品中選擇(ze)適合自己(ji)的一(yi)款(kuan)呢？下面小編的分享希望給大家(jia)帶來一(yi)些(xie)思(si)路。

派森(sen)諾單(dan)細胞轉(zhuan)錄組(zu)測序產品

3’端(duan)單(dan)細胞轉錄組測序(xu)是(shi)目前使用(yong)最廣泛的單(dan)細胞測序(xu)產品，基于(yu)10x Genomics Chromium平臺的微(wei)流(liu)控體系，核(he)心原理是(shi)通過Ploy  T捕獲含(han)Ploy A尾的轉錄本，所以適用(yong)于(yu)所有(you)含(han)Ploy A尾的真核(he)生物。

做3’端單(dan)(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄組測序(xu)，有兩個關鍵點至關重要(yao)。第一，獲(huo)得(de)質量良好(hao)的(de)單(dan)(dan)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)(ye)，這是提高(gao)測序(xu)質量的(de)必要(yao)條件。但不(bu)同物種、不(bu)同樣(yang)(yang)本(ben)類型(xing)的(de)解(jie)離(li)(li)成功率相差巨大(da)。經過多(duo)年的(de)沉(chen)淀(dian)，派森諾(nuo)(nuo)對于樣(yang)(yang)本(ben)解(jie)離(li)(li)已有豐(feng)富(fu)的(de)項目經驗(yan)。截至2024年派森諾(nuo)(nuo)單(dan)(dan)細胞(bao)平(ping)臺已成功完(wan)成千例(li)單(dan)(dan)細胞(bao)樣(yang)(yang)本(ben)測序(xu)，不(bu)管(guan)是動物樣(yang)(yang)本(ben)如血液(ye)(ye)、腦組織、脊髓(sui)、胰腺、肝臟(zang)、腎(shen)臟(zang)、腸、肺、視網膜等，還是植物樣(yang)(yang)本(ben)如禾本(ben)科(ke)、十字(zi)花科(ke)、葫蘆(lu)科(ke)等都不(bu)在話下。特別(bie)在如骨(gu)組織、胰腺、眼球、皮(pi)膚和植物原生質體等疑(yi)難(nan)樣(yang)(yang)本(ben)方面，派森諾(nuo)(nuo)都有著豐(feng)富(fu)的(de)成功解(jie)離(li)(li)經驗(yan)。詳情(qing)請看：（）

目(mu)前派森(sen)(sen)諾正在(zai)舉行疑難樣品免費解(jie)離的(de)活動，如果對樣品是(shi)否(fou)能做單(dan)細胞測序(xu)有疑問，歡(huan)迎聯系(xi)派森(sen)(sen)諾銷售人員。

第二，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)準(zhun)確度。細(xi)(xi)(xi)胞(bao)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)結(jie)果決定了(le)后續(xu)數據(ju)分析(xi)走(zou)向，所(suo)(suo)以(yi)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)結(jie)果對(dui)(dui)后續(xu)分析(xi)影響很大(da)(da)。目(mu)前，軟件自(zi)動化(hua)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)方(fang)(fang)(fang)法方(fang)(fang)(fang)便(bian)且(qie)系統化(hua)，但完全依賴于參考數據(ju)集(ji)，注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)的(de)(de)結(jie)果并不(bu)是高置信度注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)。為了(le)提高細(xi)(xi)(xi)胞(bao)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)的(de)(de)高置信度，防止(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)的(de)(de)缺失或者比例異(yi)常，需要專(zhuan)(zhuan)業的(de)(de)人工(gong)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)。在人工(gong)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)中(zhong)，不(bu)僅要對(dui)(dui)單個(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)基因(yin)表達進行分析(xi)，還要對(dui)(dui)其細(xi)(xi)(xi)胞(bao)簇功能富(fu)集(ji)分析(xi)，一方(fang)(fang)(fang)面借助數據(ju)庫已知的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)marker基因(yin)列表，另一方(fang)(fang)(fang)面要查閱大(da)(da)量相關文(wen)獻資料精準(zhun)鑒定細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)，此過程需要專(zhuan)(zhuan)業的(de)(de)經(jing)驗(yan)且(qie)花費(fei)大(da)(da)量的(de)(de)時間精力。所(suo)(suo)以(yi)，專(zhuan)(zhuan)業的(de)(de)人工(gong)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)目(mu)前是大(da)(da)家認可的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)的(de)(de)金標準(zhun)。派森諾(nuo)擁有自(zi)己的(de)(de)人工(gong)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)團隊，為您的(de)(de)注(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)結(jie)果保(bao)駕(jia)護航。

3’端(duan)轉錄(lu)組測序實驗原理(li)

5’端免(mian)疫(yi)組庫目前適用于人(ren)和(he)小鼠。免(mian)疫(yi)細(xi)胞(bao)針對紛(fen)繁(fan)復雜(za)的(de)入(ru)侵病(bing)原(yuan)體的(de)免(mian)疫(yi)反應，依賴于其高度多樣性(xing)的(de)抗原(yuan)識別受體B細(xi)胞(bao)表面受體（BCR）和(he)T細(xi)胞(bao)表面受體（TCR）。而V（D）J基因是編碼BCR/TCR可變區的(de)基因，可以通過基因重(zhong)排(pai)產生多種BCR/TCR，使(shi)其可以適應多種抗原(yuan)，滿足(zu)機體特異性(xing)免(mian)疫(yi)的(de)需求。

基于10×Genomics的(de)單細胞(bao)測序(xu)(xu)系統，可以實現高通(tong)量(liang)(liang)的(de)5’端單細胞(bao)轉錄(lu)組和(he)V（D）J測序(xu)(xu)，通(tong)過(guo)微(wei)流控(kong)系統將帶有(you)條形碼和(he)引物(wu)的(de)凝(ning)膠珠(zhu)與單個細胞(bao)包裹在油(you)滴中(zhong)；接下(xia)來在每個油(you)滴中(zhong)，凝(ning)膠珠(zhu)溶解(jie)，細胞(bao)裂解(jie)釋放(fang)mRNA，通(tong)過(guo)逆(ni)轉錄(lu)產(chan)生(sheng)帶有(you)barcode和(he)UMI 信息的(de)cDNA。破油(you)之后，cDNA一分(fen)為(wei)二，后續同(tong)時進行(xing)基因(yin)表(biao)達和(he)免疫(yi)組庫的(de)文庫構建(jian)。其中(zhong)TCR/BCR的(de)V（D）J序(xu)(xu)列通(tong)過(guo)設計在C區的(de)巢式引物(wu)進行(xing)PCR富集；而mRNA保留的(de)是(shi)5’端的(de)信息，測序(xu)(xu)后即可獲得大量(liang)(liang)單細胞(bao)的(de)基因(yin)表(biao)達和(he)免疫(yi)組庫數據。

5’端(duan)免疫組(zu)庫實驗原(yuan)理

染色(se)質將大量的(de)DNA壓縮成細(xi)(xi)胞(bao)核，使只(zhi)有一小(xiao)部分(fen)的(de)DNA可(ke)(ke)以(yi)(yi)在(zai)(zai)每個細(xi)(xi)胞(bao)內(nei)進行轉錄。10x Genomics可(ke)(ke)以(yi)(yi)在(zai)(zai)單(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)表觀基因組學水平上揭示染色(se)質可(ke)(ke)接(jie)近性(xing)。該方案通過快速(su)高效的(de)單(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)標記、測序和分(fen)析，可(ke)(ke)一次性(xing)獲(huo)得(de)成千(qian)上萬個單(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)染色(se)質譜，獲(huo)得(de)單(dan)(dan)細(xi)(xi)胞(bao)水平的(de)染色(se)質開放區域信息。

10x ATAC技術(shu)核(he)(he)心是油(you)滴包裹的(de)(de)凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)珠(zhu)(zhu)（GEM），每個凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)珠(zhu)(zhu)都帶有獨(du)特(te)的(de)(de)寡核(he)(he)苷酸條形碼序(xu)(xu)列，包含P5測(ce)序(xu)(xu)接頭、10xBarcode序(xu)(xu)列、Read1N序(xu)(xu)列。Tn5酶孵育(yu)單(dan)細(xi)胞(bao)核(he)(he)懸液，Tn5轉座(zuo)酶可(ke)以滲(shen)透進(jin)入細(xi)胞(bao)核(he)(he)膜(mo)，在細(xi)胞(bao)核(he)(he)內完成基因組DNA開(kai)(kai)放區的(de)(de)切割。發生(sheng)轉座(zuo)反應(ying)的(de)(de)DNA，包含不同(tong)大小的(de)(de)片(pian)段，在被轉座(zuo)酶處理后(hou)，細(xi)胞(bao)核(he)(he)中的(de)(de)基因組開(kai)(kai)放區已經被切碎，且被接上(shang)了特(te)定的(de)(de)接頭，以便和凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)珠(zhu)(zhu)結合。在微流控芯(xin)片(pian)上(shang)將(jiang)孵育(yu)好的(de)(de)單(dan)細(xi)胞(bao)核(he)(he)懸液與(yu)預混(hun)液、帶有barcode的(de)(de)凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)珠(zhu)(zhu)和分液油(you)進(jin)行(xing)混(hun)合，將(jiang)成千上(shang)萬個細(xi)胞(bao)核(he)(he)分配(pei)到納升(sheng)級的(de)(de)GEM（Gel Beads-in-emulsion）中， 收集GEMs后(hou)，進(jin)行(xing)線性擴(kuo)增(zeng)，來(lai)自同(tong)一(yi)個細(xi)胞(bao)的(de)(de)DNA片(pian)段被標記上(shang)同(tong)一(yi)個barcode，隨后(hou)破油(you)純化(hua)產物，構建可(ke)用于測(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)NGS文庫。

實驗原(yuan)理

與(yu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)一樣，即使(shi)(shi)是同一個遺(yi)傳背(bei)景(jing)下(xia)的(de)微生物(wu)也存在(zai)異質性。在(zai)過去，微生物(wu)由于(yu)其轉錄(lu)本含量低、半衰(shuai)期短、拷貝數低、原核生物(wu)無Ploy A尾、細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜和細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)壁厚且(qie)復雜等原因(yin)無法在(zai)高通量單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)層面研究微生物(wu)的(de)異質性。經(jing)過深入(ru)的(de)探索與(yu)創新，派森諾(nuo)在(zai)使(shi)(shi)用Tween 20透化細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜，溶(rong)菌酶(mei)溶(rong)解細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)壁，胞(bao)(bao)(bao)(bao)內rRNA去除試(shi)劑去除rRNA方面實現(xian)重大突(tu)破，再(zai)通過10x單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)平臺的(de)微流控(kong)體(ti)系，使(shi)(shi)帶有條形碼(ma)和引物(wu)的(de)凝膠珠與(yu)單個細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)包裹在(zai)油滴中， 用隨(sui)機引物(wu)進行(xing)mRNA捕獲，實現(xian)無polyA尾的(de)mRNA模板轉換(huan)，并以mRNA為模板反轉成(cheng)cDNA，進行(xing)建庫測序。目前，派森諾(nuo)也是唯一使(shi)(shi)用10x平臺來(lai)做(zuo)微生物(wu)單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)轉錄(lu)組測序的(de)公司，并成(cheng)功將rRNA占比控(kong)制在(zai)7%以下(xia)。

微(wei)生物單細(xi)胞轉錄(lu)組測序(xu)數據結果(guo)-數據質控

微生物單細胞轉錄組(zu)測序原理

部分結(jie)果展(zhan)示（大腸桿菌）

派森諾空間轉錄組(zu)測序(xu)產(chan)品

單(dan)細胞(bao)轉錄組測(ce)序(xu)雖(sui)然能(neng)(neng)夠積(ji)累大量關于細胞(bao)類(lei)型特異性(xing)基因(yin)調控(kong)的信息(xi)，但它們(men)在(zai)處理(li)過(guo)程中(zhong)破(po)壞了原始組織結(jie)(jie)構(gou)，丟失了空間位(wei)置(zhi)信息(xi)。而空間轉錄組學技(ji)術能(neng)(neng)夠在(zai)保留樣本空間位(wei)置(zhi)信息(xi)的同時，采(cai)用測(ce)序(xu)技(ji)術獲得基因(yin)表達(da)數據，從而更全面、直(zhi)觀地分析組織結(jie)(jie)構(gou)。

單細胞(bao)轉(zhuan)錄組(zu)與空(kong)間轉(zhuan)錄組(zu)對比

目前，派森諾共有4種單細胞轉(zhuan)錄組產品供大(da)家(jia)選(xuan)擇：

10x Visium空間(jian)轉(zhuan)錄(lu)組是將組織樣本透化后(hou)，mRNA從(cong)組織滲(shen)透到空間(jian)基因表達(da)玻(bo)片，再基于Ploy T 捕獲(huo)mRNA的Ploy（A）尾，進(jin)行反轉(zhuan)錄(lu)合成(cheng)cDNA后(hou)進(jin)行建庫(ku)測序，其主(zhu)要在含(han)有空間(jian)barcode的玻(bo)片上完成(cheng)。

10x Visium空間基(ji)因表達玻片(pian)每個捕獲區域內包含(han)約5000個55 μm直徑的(de)帶有空間位置標簽(qian)的(de)圓形spot點，spot點之間間隔45 μm，所以其分(fen)辨率還未達到單細(xi)胞水平。

實驗原理(li)與實驗流程

2022年底10x Genomics推出(chu)了針對(dui)人和小鼠的空(kong)間轉錄組測序(xu)方(fang)案-Visium CytAssist，打破了石(shi)蠟包埋（FFPE）樣本不(bu)適合(he)做(zuo)高通量測序(xu)的刻板(ban)印象。

與(yu)10x Visium相同的是，CytAssist空(kong)間基因表達玻(bo)片每個捕(bu)獲(huo)區域內同樣包含5000個55μm直(zhi)徑的帶有空(kong)間位置(zhi)標簽(qian)的圓形spot點，所以(yi)分辨(bian)率與(yu) Visium相同。

基因表達玻片(pian)構造(zao)

與Visium不同的(de)是， CytAssist是基(ji)于(yu)探(tan)針(zhen)捕獲(huo)的(de)原(yuan)理(li)來進(jin)(jin)行mRNA捕獲(huo)，基(ji)因(yin)(yin)檢出率更加優秀。針(zhen)對(dui)(dui)(dui)小(xiao)鼠（2萬(wan)個基(ji)因(yin)(yin)）和(he)人(ren)(ren)（1.8萬(wan)個基(ji)因(yin)(yin)）的(de)基(ji)因(yin)(yin)數據庫設計了(le)探(tan)針(zhen)，每一個基(ji)因(yin)(yin)（人(ren)(ren)和(he)小(xiao)鼠），都(dou)預先設計了(le)一對(dui)(dui)(dui)probe（人(ren)(ren)基(ji)因(yin)(yin)3對(dui)(dui)(dui)，小(xiao)鼠基(ji)因(yin)(yin)1對(dui)(dui)(dui)）以(yi)靶(ba)定RNA的(de)特定序(xu)(xu)列(lie)。左端探(tan)針(zhen)包含(han)有(you)read 2結構， 用以(yi)后(hou)續(xu)PCR擴(kuo)增，右端探(tan)針(zhen)包含(han)有(you) poly（A）結構，用以(yi)后(hou)續(xu)被玻(bo)片上的(de)序(xu)(xu)列(lie)結合。只有(you)兩段探(tan)針(zhen)同時(shi)被雜交，探(tan)針(zhen)才(cai)會進(jin)(jin)行連(lian)接，若只有(you)一段被捕獲(huo)，后(hou)續(xu)將(jiang)無(wu)法完成建庫，因(yin)(yin)此可以(yi)有(you)效降(jiang)(jiang)低假陽性(xing)。之后(hou)mRNA模板降(jiang)(jiang)解，組織(zhi)透化后(hou)，探(tan)針(zhen)序(xu)(xu)列(lie)從(cong)組織(zhi)原(yuan)位(wei)中滲透出來，與玻(bo)片上的(de)寡核(he)苷(gan)酸序(xu)(xu)列(lie)發生互補雜交。最后(hou)攜帶空間 barcode的(de)探(tan)針(zhen)序(xu)(xu)列(lie)用于(yu)進(jin)(jin)行測序(xu)(xu)文庫構建和(he)測序(xu)(xu)。

實驗原理

(3) 10x Visium Cytassist（HD）-更高(gao)分辨率(lv)的空間轉錄(lu)組測序

2024年(nian)年(nian)初(chu)，10x Genomics正(zheng)式推(tui)出(chu)Visium HD技術，該技術將空間轉(zhuan)錄組(zu)(zu)測序技術正(zheng)式推(tui)向單(dan)細(xi)胞分辨率時代(dai)。Visium  HD空間基因表達玻片(pian)每個捕(bu)獲(huo)區域內包含(han)1100萬(wan)個2x2μm帶有空間位(wei)置標(biao)簽的(de)小(xiao)方格，小(xiao)方格連續排(pai)列“無(wu)間隙(xi)”，實現全(quan)組(zu)(zu)織(zhi)覆蓋，更加還原組(zu)(zu)織(zhi)的(de)空間結構信息，獲(huo)得數據可(ke)(ke)根(gen)據不同細(xi)胞大小(xiao)選擇合適的(de)最(zui)小(xiao)分析(xi)單(dan)位(wei)實現單(dan)細(xi)胞水平的(de)空間組(zu)(zu)織(zhi)結構分析(xi)（10×官方推(tui)薦合并為8μm × 8μm，也可(ke)(ke)以根(gen)據細(xi)胞大小(xiao)調整分析(xi)單(dan)位(wei)）。

基因表達玻片結構

(4) Xenium-亞細胞水平(ping)的(de)分辨(bian)率，真正的(de)空(kong)間(jian)原(yuan)位

10x Xenium是一款組(zu)織空(kong)間原(yuan)位分(fen)析儀(yi)器(qi)，該(gai)儀(yi)器(qi)將單分(fen)子RNA檢(jian)測與強大(da)的光學元(yuan)件、數據采集和解(jie)碼技術(shu)相結(jie)合，能夠以亞細胞分(fen)辨率在(zai)整張切片上快速(su)檢(jian)測RNA表達水平(ping)。該(gai)平(ping)臺(tai)可(ke)以兼容新鮮冷凍（FF）組(zu)織和石蠟包埋（FFPE）組(zu)織。用(yong)戶(hu)可(ke)以在(zai)多個(ge)預先設計(ji)好(hao)的基因 panel中進行選擇，也可(ke)以為人類和小鼠設計(ji)附加的自定(ding)義pannel或獨立的自定(ding)義pannel。