2017-04-12
SMRT（Single Molecule, Real-Time）測(ce)序(xu)(xu)，即單(dan)分(fen)子(zi)實時測(ce)序(xu)(xu)，該方(fang)法基(ji)于納米小孔的(de)單(dan)分(fen)子(zi)讀取(qu)(qu)技(ji)術，無需擴(kuo)增即可快速完(wan)成(cheng)序(xu)(xu)列(lie)讀取(qu)(qu)。Pacific Biosciences自2013年(nian)成(cheng)功推出商業化的(de)三(san)(san)代(dai)測(ce)序(xu)(xu)儀PacBio RSII后，三(san)(san)代(dai)測(ce)序(xu)(xu)開始被廣泛(fan)應(ying)用于基(ji)因組(zu)(zu)學、轉錄組(zu)(zu)學研究中。三(san)(san)代(dai)測(ce)序(xu)(xu)技(ji)術通過其獨有的(de)環形一致性測(ce)序(xu)(xu)模式（Circular-consensus sequence，CCS），極(ji)大提高單(dan)堿基(ji)測(ce)序(xu)(xu)的(de)準確(que)(que)率(lv)，遠超Illumina等(deng)二代(dai)測(ce)序(xu)(xu)技(ji)術。與(yu)傳統(tong)轉錄組(zu)(zu)測(ce)序(xu)(xu)項目相比，利(li)用PacBio平臺的(de)全長轉錄組(zu)(zu)測(ce)序(xu)(xu)技(ji)術可以直接獲(huo)得mRNA的(de)全長，保證(zheng)了mRNA序(xu)(xu)列(lie)的(de)精確(que)(que)性。
2017年2月，美國弗吉尼亞理工大學發表題為Single molecule RNA sequencing uncovers trans-splicing and improves annotations in Anopheles stephensi的文章，以斑須按蚊為材料，通過全長轉錄組測序，揭示基因的反式剪接事件，并優化和提升了基因組的注釋。
1. 研究(jiu)目的
第三代(dai)測(ce)序技術與二代(dai)測(ce)序技術在讀長上有明顯優勢。期(qi)望利用三代(dai)測(ce)序技術的(de)優勢提升斑須按蚊的(de)基因組注釋(shi)信息并獲取cDNA的(de)全(quan)長；另一方面，反式(shi)剪(jian)(jian)接為(wei)物種進化過程中發生的(de)現象，與常規(gui)的(de)剪(jian)(jian)接方式(shi)不(bu)(bu)同，反式(shi)剪(jian)(jian)接可由來自于(yu)不(bu)(bu)同mRNA前體的(de)外顯子區域生成，本研究(jiu)擬通過全(quan)長轉錄(lu)組測(ce)序，揭示反式(shi)剪(jian)(jian)接現象。
2. 研究方法
取(qu)15頭1-3日齡雄成蟲進(jin)(jin)行混樣(yang)，提取(qu)總(zong)RNA后(hou)，利用(yong)SMRTer PCR cDNA synthesis試劑(ji)盒將mRNA進(jin)(jin)行反轉(zhuan)錄獲得cDNA，將構建(jian)好的文(wen)庫用(yong)PacBio平臺進(jin)(jin)行測序(xu)。
3. 分析結果
通(tong)過(guo)全長(chang)(chang)轉錄(lu)組測序，共得到超過(guo)60萬條(tiao)全長(chang)(chang)cDNA；通(tong)過(guo)全長(chang)(chang)轉錄(lu)組測序，4867個(ge)基因(yin)(yin)模型升級。全長(chang)(chang)轉錄(lu)組新(xin)(xin)增了(le)3323個(ge)基因(yin)(yin)mRNA的(de)UTRs信息；新(xin)(xin)發現(xian)了(le)1785個(ge)可變剪接并界定了(le)外顯子(zi)的(de)邊界；1923個(ge)基因(yin)(yin)重新(xin)(xin)對(dui)外顯子(zi)進行了(le)調(diao)整或明確發生(sheng)基因(yin)(yin)融合(he)；鑒(jian)定出6個(ge)反式剪接事件。
作者以doublesex基因為例說明對基因組注釋的改善。在原有的基因注釋信息中，doublesex基因分為兩部分，命名為ASTEI07080和ASTEI07082，通過全長轉錄組測序，將這兩部分基因合并為一個基因模型。
4. 參考文(wen)獻
Jiang X et al., Single molecule RNA sequencing uncovers trans-splicing and improves annotations in Anopheles stephensi. Insect Molecular Biology (2017).
