文章題目：National-scale antimicrobial resistance surveillance in wastewater: A comparative analysis of HT qPCR and metagenomic approaches

期(qi)刊：Water Research

影響(xiang)因子：13.4

發表時(shi)間：2024年9月15日(ri)

研究背(bei)景

抗生(sheng)(sheng)素(su)耐(nai)藥性(xing)（AMR）是(shi)一個復雜(za)的(de)問題，其影響遍及人(ren)類、動物和環境等各個方(fang)面(mian)。考慮到其多因素(su)的(de)性(xing)質，人(ren)們(men)更加強調在“一個健康”的(de)視角(jiao)下解(jie)決問題，從而認識到這些(xie)不同方(fang)面(mian)從根本上(shang)是(shi)相互關聯(lian)的(de)。廢水是(shi)抗生(sheng)(sheng)素(su)耐(nai)藥性(xing)（AMR）的(de)重要儲存庫，對其進行監測可以深入(ru)了解(jie)人(ren)群層面(mian)的(de)AMR趨勢(shi)，為(wei)公共衛生(sheng)(sheng)政策提(ti)供信息依(yi)據。

雖(sui)然國(guo)家廢水監(jian)測可以(yi)進(jin)一步加深(shen)我們(men)對廢水中(zhong)抗(kang)生素耐藥性(xing)(xing)的(de)(de)理解，但監(jian)測數(shu)據的(de)(de)價(jia)值取決于將(jiang)監(jian)測計劃的(de)(de)目標與最合適的(de)(de)方(fang)法(fa)相結合。目前(qian)對于環(huan)境中(zhong)抗(kang)生素抗(kang)性(xing)(xing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)研究，主(zhu)要有(you)宏基(ji)(ji)因(yin)組(zu)和高通量qPCR兩種(zhong)方(fang)法(fa)，之前(qian)的(de)(de)研究表明，宏基(ji)(ji)因(yin)組(zu)學的(de)(de)非(fei)靶向性(xing)(xing)提供了更廣泛覆蓋(gai)ARG譜的(de)(de)明顯(xian)優勢，但會降低(di)方(fang)法(fa)的(de)(de)靈敏(min)度，而qPCR通常對低(di)豐度基(ji)(ji)因(yin)更敏(min)感。總的(de)(de)來(lai)說(shuo)，對這兩種(zhong)方(fang)法(fa)的(de)(de)優缺點和一致性(xing)(xing)進(jin)行全面比較(jiao)的(de)(de)研究仍(reng)然有(you)限，尤其是(shi)在廢水監(jian)測方(fang)向。

本(ben)研究旨(zhi)在區分威(wei)爾(er)士全國廢水的(de)(de)空間和時間AMR分布的(de)(de)變化(hua)，并進(jin)一步(bu)評估高通(tong)量qPCR芯片和宏(hong)基(ji)因(yin)組學對不同監測(ce)目標的(de)(de)適用性。為(wei)此，每(mei)周從47個威(wei)爾(er)士污(wu)水處理(li)廠收(shou)集綜(zong)合進(jin)水樣本(ben)，并從一家大型市(shi)政醫院收(shou)集進(jin)一步(bu)的(de)(de)出水樣本(ben)（圖1）。比較了(le)這兩種方法的(de)(de)基(ji)因(yin)覆蓋率、監測(ce)高風險ARGs（定(ding)義為(wei)移動遺傳元件（MGEs）、致病宿主和人為(wei)相關的(de)(de)ARGs）的(de)(de)能(neng)力(li)，以(yi)及它們捕捉與環(huan)境(jing)變量和微生物(wu)群落有關的(de)(de)抗生素抗性基(ji)因(yin)組成變化(hua)的(de)(de)能(neng)力(li)。

圖(tu)(tu)1 地圖(tu)(tu)顯示用(yong)于(yu)樣本收集的47個(ge)城(cheng)市污(wu)水處理廠和醫院

研究方法

1、廢水樣品采集(ji)和處理

2、廢水DNA提取(qu)

3、高通量qPCR（共使用96組引物進行高通量qPCR實驗(yan)，其中ARGs（73個(ge)基因(yin)(yin)）、MGEs（10個(ge)基因(yin)(yin)）、病原菌（5個(ge)基因(yin)(yin)）以及金(jin)屬和殺菌劑抗性基因(yin)(yin)等(deng)8個(ge)其他基因(yin)(yin)）

4、宏基(ji)因組文(wen)庫的構(gou)建(jian)和測序

5、序(xu)列數據的生(sheng)物信息學分析

6、統計分析

研(yan)究結果(guo)

兩種方法對廢水中ARGs數量和豐度(du)量化的影(ying)響(xiang)

在(zai)污(wu)(wu)水處理(li)廠(chang)污(wu)(wu)水和醫(yi)(yi)(yi)院污(wu)(wu)水中(zhong)(zhong)(zhong)平均分(fen)別(bie)觀(guan)察到(dao)(dao)181和227個(ge)個(ge)體arg（圖(tu)2.A）。在(zai)所有樣(yang)(yang)本中(zhong)(zhong)(zhong)總共檢測(ce)(ce)到(dao)(dao)491個(ge)獨(du)特(te)的(de)ARGs，其中(zhong)(zhong)(zhong)61個(ge)也通過(guo)qPCR芯片檢測(ce)(ce)到(dao)(dao)（圖(tu)2.C）。雖然 qPCR芯片僅限(xian)于(yu)73種目標ARGs，但兩(liang)種方(fang)法都能(neng)在(zai)醫(yi)(yi)(yi)院廢(fei)水樣(yang)(yang)本中(zhong)(zhong)(zhong)檢測(ce)(ce)到(dao)(dao)顯著性更(geng)高的(de)豐富度。盡管如此，宏基因組(zu)分(fen)析在(zai)污(wu)(wu)水處理(li)廠(chang)污(wu)(wu)水中(zhong)(zhong)(zhong)檢測(ce)(ce)到(dao)(dao)的(de)獨(du)特(te)ARGs數(shu)量(liang)高于(yu)醫(yi)(yi)(yi)院污(wu)(wu)水（圖(tu)2.B），這可能(neng)是由(you)于(yu)污(wu)(wu)水處理(li)廠(chang)的(de)采樣(yang)(yang)點數(shu)量(liang)更(geng)多。

無論(lun)是(shi)qPCR芯(xin)片(pian)還是(shi)宏(hong)基(ji)因座數據，污水處理廠樣本中(zhong)ARGs的總相對豐(feng)(feng)度(du)都(dou)明顯低于(yu)醫院(yuan)廢水。大環內酯(zhi)類(lei)酰胺鏈霉素(su)（MLS）、四環素(su)、β-內酰胺和(he)(he)氨基(ji)糖(tang)苷類(lei)抗菌藥(yao)物的ARGs在兩(liang)組(zu)數據中(zhong)都(dou)占主導地(di)位（圖(tu)3A和(he)(he)B)。兩(liang)組(zu)數據中(zhong)醫院(yuan)廢水中(zhong)糖(tang)肽抗性基(ji)因的相對豐(feng)(feng)度(du)顯著(zhu)增(zeng)加(jia)。然(ran)而，宏(hong)基(ji)因組(zu)數據中(zhong)進一步揭示了利(li)福平和(he)(he)阿(a)爾法霉素(su)的ARGs的高豐(feng)(feng)度(du)，而qPCR芯(xin)片(pian)由于(yu)沒有(you)使用對應引物，所以沒有(you)對應的檢測數據。

在73個(ge)qPCR芯(xin)片(pian)檢(jian)(jian)測(ce)的(de)(de)(de)ARGs范(fan)圍(wei)內(nei)，廢水樣品中(zhong)(zhong)只有(you)mecA未(wei)被(bei)(bei)檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)（圖2.B）。相比(bi)之下，宏(hong)基因組(zu)分(fen)別在污(wu)水處理廠廢水和(he)(he)醫院(yuan)廢水中(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)54和(he)(he)58個(ge)qPCR芯(xin)片(pian)目(mu)標ARGs。其(qi)中(zhong)(zhong)未(wei)被(bei)(bei)檢(jian)(jian)測(ce)出(chu)的(de)(de)(de)包括部分(fen)高風險的(de)(de)(de)arg，如(ru)mdtL、blaNDM和(he)(he)blaVIM。宏(hong)基因組(zu)數據的(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)頻率一直很低，在至(zhi)少20%的(de)(de)(de)廢水樣本中(zhong)(zhong)，qPCR芯(xin)片(pian)的(de)(de)(de)73個(ge)目(mu)標arg中(zhong)(zhong)只有(you)35個(ge)被(bei)(bei)檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)。通過(guo)qPCR芯(xin)片(pian)分(fen)析(xi)發現，aadA7、qepA和(he)(he)vanA等ARGs的(de)(de)(de)相對(dui)豐度(du)較高，而(er)通過(guo)宏(hong)基因組(zu)分(fen)析(xi)發現，tetW、blaCTX和(he)(he)vanRA的(de)(de)(de)相對(dui)豐度(du)較高。

不同樣(yang)(yang)本(ben)類型之間比較發(fa)(fa)現(xian)，qPCR芯(xin)片和宏(hong)基因(yin)組在(zai)(zai)污(wu)水(shui)處理廠廢水(shui)中msrE和tet39的相(xiang)(xiang)對豐度(du)與醫(yi)院(yuan)污(wu)水(shui)相(xiang)(xiang)比，顯著(zhu)增加方面是一(yi)致的，而(er)ermB則(ze)相(xiang)(xiang)反(fan)。宏(hong)基因(yin)組數據進一(yi)步發(fa)(fa)現(xian)，污(wu)水(shui)處理廠樣(yang)(yang)本(ben)中ctx的相(xiang)(xiang)對豐度(du)顯著(zhu)更高，而(er)醫(yi)院(yuan)樣(yang)(yang)本(ben)中vanRA的相(xiang)(xiang)對豐度(du)顯著(zhu)更高。相(xiang)(xiang)比之下，qPCR芯(xin)片在(zai)(zai)醫(yi)院(yuan)樣(yang)(yang)本(ben)中檢測到的aadA7相(xiang)(xiang)對豐度(du)要高得多(duo)，在(zai)(zai)污(wu)水(shui)處理廠樣(yang)(yang)本(ben)中檢測到的vanA相(xiang)(xiang)對豐度(du)要高得多(duo)。

NMDS用于比較醫院和污水處理廠廢水樣(yang)本中的(de)ARG組成隨(sui)時(shi)間(jian)的(de)變化(hua)。不(bu)論(lun)是(shi)(shi)qPCR芯(xin)片還是(shi)(shi)宏基因組，都(dou)顯示(shi)ARG在不(bu)同地點明顯聚(ju)集（圖4）。在評估時(shi)間(jian)變化(hua)對(dui)ARGs的(de)影(ying)響(xiang)時(shi)，采樣(yang)時(shi)間(jian)對(dui)污水處理廠樣(yang)品的(de)ARG組成沒有(you)明顯的(de)影(ying)響(xiang)。相比之下，醫院樣(yang)品的(de)組成在當月發生了明顯的(de)變化(hua)。

在(zai)評(ping)估采樣地(di)(di)點對(dui)污水(shui)處理(li)廠ARGs組成分(fen)布的(de)(de)影響時，NMDS分(fen)析發現，ARGs的(de)(de)組成按地(di)(di)理(li)區域聚類(lei)，如圖1所示。這種效應在(zai)一定程度上可以用離(li)散度來解釋。在(zai)這三個地(di)(di)區中，來自北威爾士(shi)和南威爾士(shi)的(de)(de)ARGs差異最大。相對(dui)于16S rRNA基因(yin)拷貝(bei)數(shu)的(de)(de)ARG總豐度也(ye)因(yin)采樣位點的(de)(de)不(bu)同而不(bu)同，因(yin)此，使用qPCR芯片數(shu)據確(que)定的(de)(de)ARG的(de)(de)平均(jun)總相對(dui)豐度在(zai)南威爾士(shi)顯著低(di)于北威爾士(shi)。

基(ji)于距離的(de)(de)冗余(yu)分析（dbRDA）顯(xian)(xian)示，人(ren)為變(bian)量(liang)和(he)(he)環境(jing)變(bian)量(liang)對(dui)污水(shui)ARGs產生了顯(xian)(xian)著的(de)(de)影響，qPCR芯片和(he)(he)宏基(ji)因(yin)組調整后R2分別為0.285 （p < 0.01）和(he)(he)0.207 (p < 0.01)（圖5）。這兩種(zhong)方法一致(zhi)發(fa)現(xian)(xian)環境(jing)變(bian)量(liang)導致(zhi)了ARG譜中(zhong)更大比例(li)(li)的(de)(de)差異(yi)。其中(zhong)銨的(de)(de)影響最(zui)大（R2 = 0）。但(dan)是，兩種(zhong)方法對(dui)于某(mou)些變(bian)量(liang)的(de)(de)影響，結(jie)果之間(jian)存在一些微小的(de)(de)差異(yi)。例(li)(li)如，通過對(dui)完整數(shu)據的(de)(de)宏基(ji)因(yin)組分析，發(fa)現(xian)(xian)電導率導致(zhi)的(de)(de)百分比是顯(xian)(xian)著的(de)(de)，然而在qPCR芯片中(zhong)并沒有發(fa)現(xian)(xian)這種(zhong)顯(xian)(xian)著性(p = 0）。對(dui)于人(ren)為變(bian)量(liang)，雖然它們的(de)(de)個(ge)體影響在三個(ge)數(shu)據中(zhong)均(jun)顯(xian)(xian)著，但(dan)每個(ge)變(bian)量(liang)導致(zhi)的(de)(de)差異(yi)百分比較低。

不同樣(yang)本微生物群落的組(zu)成在污水處理廠和(he)醫院廢水之間存在差異，它們(men)與ARGs的組(zu)成相(xiang)關（PERMANOVA p < 0.01, PERMDISP p > 0.05），并且在醫院廢水樣(yang)本中隨著(zhu)時(shi)間的推移發(fa)生變化。酸多菌(jun)屬(shu)（Acidovorax）、不動(dong)桿(gan)菌(jun)屬(shu)（Acinetobacter）和(he)假單(dan)胞菌(jun)屬(shu)（Pseudomonas）是(shi)三個最豐富的屬(shu)，其中假單(dan)胞菌(jun)屬(shu)（Pseudomonadota）是(shi)所有樣(yang)本的優勢屬(shu)。

作為潛在宿主細菌(jun)的(de)(de)(de)(de)標志，通過(guo)網(wang)絡(luo)分(fen)析探索了細菌(jun)屬(shu)和ARG之間(jian)的(de)(de)(de)(de)關聯模式，基(ji)于強（ρ > 0.7）和顯(xian)著（p < 0.01）的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)關性（圖(tu)(tu)6）。結(jie)果表明對四(si)環素(su)類耐藥的(de)(de)(de)(de)ARG與(yu)(yu)不同屬(shu)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)關性最高(gao)。例(li)如，qPCR芯片和宏(hong)基(ji)因(yin)組都發(fa)現(xian)tetO和tetW與(yu)(yu)兩個高(gao)度豐(feng)富的(de)(de)(de)(de)桿菌(jun)屬(shu)Blautia和Faecalibacterium表現(xian)出特別強的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)關性（ρ > 0.9）。宏(hong)基(ji)因(yin)組發(fa)現(xian)了qPCR芯片未發(fa)現(xian)的(de)(de)(de)(de)進一步相(xiang)(xiang)關性，包括假(jia)單胞(bao)菌(jun)與(yu)(yu)MLS ARGs mefA和msrD之間(jian)的(de)(de)(de)(de)關系（圖(tu)(tu)5.B）。然而值(zhi)得注意(yi)的(de)(de)(de)(de)是，無論從哪種方法分(fen)析數(shu)據，大多數(shu)豐(feng)富的(de)(de)(de)(de)arg都沒有顯(xian)示出與(yu)(yu)任何細菌(jun)屬(shu)的(de)(de)(de)(de)任何顯(xian)著相(xiang)(xiang)關性。

結 論

抗生素抗性基因檢測在監測新出現的健(jian)康威脅(xie)、為公共衛(wei)生政策(ce)的制(zhi)定(ding)提供(gong)信息方(fang)面具有巨(ju)大(da)潛力(li)，并對未來(lai)研究提供(gong)巨(ju)大(da)價值。本研究全(quan)面比較了高通量qPCR芯片技術(shu)與宏基因組(zu)技術(shu)，如表1所(suo)示。

高通(tong)量qPCR芯片(pian)技(ji)術(shu)(shu)具有更高的(de)(de)(de)(de)靈敏度(du)(du)(du)，可以檢(jian)測(ce)所有的(de)(de)(de)(de)目標arg，包(bao)(bao)括低表達的(de)(de)(de)(de)arg豐度(du)(du)(du)。其中包(bao)(bao)括可移動的(de)(de)(de)(de)金屬-β-內酰胺酶基(ji)因blaNDM以及多藥耐藥基(ji)因mdtL，這兩種基(ji)因都(dou)被認為對(dui)人類健(jian)康構成高風險(xian)。qPCR芯片(pian)監測(ce)低豐度(du)(du)(du)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)能(neng)力(li)將(jiang)有助于早(zao)期發現涉及已確定的(de)(de)(de)(de)高風險(xian)ARGs的(de)(de)(de)(de)暴發，并確保(bao)常規監測(ce)數據的(de)(de)(de)(de)連(lian)續性。先前對(dui)廢水(shui)和糞便(bian)的(de)(de)(de)(de)研究(jiu)也發現，qPCR技(ji)術(shu)(shu)能(neng)更好(hao)地區(qu)分ARG相對(dui)豐度(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)較小偏差(cha)。

另一方面(mian)，由(you)于高通量 qPCR芯(xin)片僅限于檢測預(yu)先(xian)確定(ding)(ding)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)，而宏(hong)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組學可(ke)以(yi)更好地(di)捕捉抗性基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)多樣性。宏(hong)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組不(bu)受(shou)特定(ding)(ding)引物的(de)(de)限制(zhi)，更適合評估總體ARG水(shui)平。宏(hong)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組數據的(de)(de)組裝可(ke)以(yi)用于將(jiang)arg與宿主(zhu)細(xi)菌，MGEs和共定(ding)(ding)位(wei)的(de)(de)耐(nai)藥基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)聯系起來。因(yin)此，宏(hong)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組數據有利于實現(xian)人類(lei)健康風(feng)險評估和進化(hua)分析等目(mu)標。

本(ben)研(yan)究(jiu)首次(ci)比較了高通量qPCR芯片和(he)宏(hong)基(ji)因組在廢(fei)水中(zhong)(zhong)抗生素(su)抗性監測中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)應用。它為尋求(qiu)設(she)計(ji)有效的(de)(de)(de)抗微生物藥物及廢(fei)水監測策(ce)略提供了有價值的(de)(de)(de)指導(dao)。宏(hong)基(ji)因組學可(ke)以對(dui)(dui)ARGs進行全面的(de)(de)(de)概述(shu)，并(bing)有可(ke)能(neng)(neng)為ARG風險評估(gu)提供關(guan)(guan)鍵的(de)(de)(de)背景信(xin)息(xi)。高通量qPCR芯片具有更(geng)高的(de)(de)(de)靈敏度，能(neng)(neng)夠反映全ARG分布的(de)(de)(de)組成時空動態。盡管如(ru)此，不同方法之間靈敏度和(he)覆蓋率(lv)的(de)(de)(de)差異確實影(ying)響(xiang)了檢測到的(de)(de)(de)ARGs及其(qi)豐(feng)度，影(ying)響(xiang)關(guan)(guan)于(yu)影(ying)響(xiang)因素(su)的(de)(de)(de)數據(ju)解讀方式。對(dui)(dui)每種技術的(de)(de)(de)能(neng)(neng)力(li)和(he)資源(yuan)需(xu)求(qiu)的(de)(de)(de)深入了解將有助于(yu)使監測工(gong)作朝著具體目(mu)標(biao)發展，加強未來(lai)對(dui)(dui)抗生素(su)抗性基(ji)因的(de)(de)(de)監測。

總(zong)體而言，宏基(ji)(ji)因組提供(gong)了更全面(mian)的(de)(de)(de)(de)抗生素抗性(xing)基(ji)(ji)因譜(pu)，而高通量(liang)qPCR芯片可(ke)以對臨床耐藥重要基(ji)(ji)因進(jin)行敏感定量(liang)。我們強調(diao)選擇(ze)與監測目標一致的(de)(de)(de)(de)適(shi)當方(fang)法的(de)(de)(de)(de)重要性(xing)，從而制定有效的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)于(yu)環(huan)境(jing)抗生素抗性(xing)傳播的(de)(de)(de)(de)監測計劃。