引言

免(mian)(mian)疫系統的復(fu)雜性(xing)和(he)多樣性(xing)使得在(zai)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)水平研(yan)究免(mian)(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的功能(neng)(neng)和(he)特性(xing)至(zhi)關重(zhong)(zhong)要。單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)免(mian)(mian)疫組庫測序（5’scRNA + TCR/BCR）技術是(shi)一(yi)種(zhong)能(neng)(neng)夠(gou)在(zai)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)層面同時解析細(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉錄組信息和(he) T 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)受體(ti)（TCR）、B 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)受體(ti)（BCR）基因(yin)重(zhong)(zhong)排(pai)情況的前沿技術，這項技術為(wei)深(shen)入理解免(mian)(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的發育(yu)、分化(hua)、抗原識(shi)別機制(zhi)等提供(gong)了(le)可(ke)能(neng)(neng)。在(zai)疾病(bing)研(yan)究中，無論(lun)是(shi)感染性(xing)疾病(bing)、自身免(mian)(mian)疫病(bing)還是(shi)腫瘤，它都像是(shi)一(yi)把精準的鑰匙，幫助我(wo)們開啟探(tan)索(suo)免(mian)(mian)疫反(fan)應奧(ao)秘的大門，為(wei)診斷、治療和(he)疫苗研(yan)發等應用領域帶(dai)來全新視(shi)角。

一、數據來源背景介紹

在機體免疫系統中 T 細胞受體（TCR）和 B 細胞受體（BCR）的序列多樣性的總和被定義為免疫(yi)組庫。TCR\BCR具有抗原識別(bie)能(neng)力的(de)(de)高(gao)度可變區(qu)(qu)域CDR3區(qu)(qu)分(fen)布在(zai)mRNA的(de)(de)5端，TCR的(de)(de)CDR3區(qu)(qu)包括(kuo)α鏈(lian)(lian)V、J基(ji)因(yin)片段(duan)(duan)(duan)和和β鏈(lian)(lian)V、D、J基(ji)因(yin)片段(duan)(duan)(duan)，BCR的(de)(de)CDR3區(qu)(qu)包括(kuo)輕鏈(lian)(lian)V、J基(ji)因(yin)片段(duan)(duan)(duan)和重(zhong)鏈(lian)(lian)V、D、J基(ji)因(yin)片段(duan)(duan)(duan)，V（D）J 基(ji)因(yin)基(ji)因(yin)重(zhong)排或重(zhong)組構(gou)成了免疫組庫(ku)序(xu)列的(de)(de)多樣(yang)性。

單(dan)細(xi)(xi)胞免疫(yi)組庫(ku)測序(xu)（5’scRNA + TCR/BCR）是以 10x Genomics 平臺的液(ye)滴微流(liu)控技術(shu)為(wei)基礎在(zai)單(dan)個(ge)細(xi)(xi)胞層面同時對轉(zhuan)錄組基因表(biao)達情(qing)況(kuang)和(he) TCR/BCR 序(xu)列(lie)多樣性進行(xing)檢測的測序(xu)技術(shu)，最(zui)終，可以獲得兩個(ge)數據文庫(ku)，分別(bie)是單(dan)細(xi)(xi)胞 5 端基因表(biao)達文庫(ku)和(he)免疫(yi)組庫(ku)（V (D) J 文庫(ku)）。

單細胞免疫組庫測序

二、數據分析流程

數(shu)據(ju)下(xia)機后后我們會對數(shu)據(ju)進行進一步質(zhi)控過(guo)濾，進行細(xi)胞類(lei)型(xing)(xing)鑒定和克隆型(xing)(xing)分析，解析免疫細(xi)胞異(yi)質(zhi)性和克隆型(xing)(xing)多(duo)樣性。

單細胞免疫組庫測序(xu)數據分(fen)析流程

三、數(shu)據分析思路

單細(xi)胞免(mian)疫(yi)組庫(ku)數據分(fen)析的核心思路(lu)就是篩(shai)選目標細(xi)胞亞型及克(ke)(ke)隆(long)型，解析免(mian)疫(yi)細(xi)胞的異質性、細(xi)胞亞型的分(fen)化(hua)轉移(yi)狀態、克(ke)(ke)隆(long)型多樣性等。

單(dan)細胞(bao)免(mian)疫組庫測(ce)序數據(ju)分析(xi)思(si)路

1）鑒(jian)定細胞類(lei)型和克隆型

對(dui)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)進(jin)行聚類(lei)分(fen)群和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)注(zhu)釋，構(gou)建(jian)組織細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)圖譜，鑒定免疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)(xing)(xing)及不同細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞群，解析(xi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的異質性(xing)及免疫特征。對(dui)多種克(ke)隆型(xing)(xing)(xing)進(jin)行分(fen)型(xing)(xing)(xing)和注(zhu)釋鑒定，解析(xi)CDR3序(xu)列特征和V（D）J基因特征，將具(ju)有相同或相似抗原(yuan)識(shi)別能力(li)（具(ju)有相同 TCR/BCR 序(xu)列）的免疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)歸為同一(yi)克(ke)隆型(xing)(xing)(xing)（Clonotype），從而了解免疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群體的克(ke)隆結構(gou)。

分(fen)析方法：細(xi)胞(bao)大類注釋、CDR3序列特(te)征(zheng)分析、V（D）J基因特(te)征(zheng)分析、TopN 克隆展示（篩選關(guan)注頻率高的克隆型）。

細胞圖譜

CDR3長度分布圖

VJ基因使用分布

TopN 克隆型(xing)在 UMAP 中的映射圖(tu)

2）免疫細胞亞群克(ke)隆擴增(zeng)差異(yi)分析

為了揭(jie)示細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)型(xing)的(de)TCR\BCR克隆多(duo)樣(yang)性，先對T\B細(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行再分(fen)群分(fen)析，鑒定不同的(de)亞(ya)型(xing)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)異質性和(he)(he)功(gong)能(neng)，通過對基因(yin)表(biao)達數據的(de)分(fen)析和(he)(he)組間差異分(fen)析篩(shai)選出目標免疫(yi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)型(xing)，對目標細(xi)(xi)胞(bao)(bao)群統(tong)計(ji)該細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中的(de)抗(kang)原受體克隆多(duo)樣(yang)性及克隆型(xing)擴(kuo)增頻率(lv)，同時篩(shai)選潛在的(de)V（D）J基因(yin)。例如，發現某些細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)型(xing)具有獨特的(de)克隆型(xing)分(fen)布，這(zhe)可能(neng)與它們在免疫(yi)反應(ying)中的(de)特殊功(gong)能(neng)相關。

分(fen)析方法：細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)群細(xi)分(fen)、組間差異分(fen)析、免(mian)疫細(xi)胞(bao)(bao)各(ge)亞(ya)群 clonetype頻數(shu)分(fen)布（解析不同(tong)細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)型(xing)的(de)克(ke)隆(long)擴增情況(kuang)）、免(mian)疫細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)型(xing)V（D）J基(ji)因 Usage 熱(re)圖(tu)（分(fen)析不同(tong)免(mian)疫細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)型(xing)中(zhong)V（D）J基(ji)因的(de)使用情況(kuang)）。

細胞亞群細分

細胞亞群組(zu)間(jian)占(zhan)比(bi)分析

克隆型頻數

V（D）J基(ji)因(yin) Usage 熱圖(tu)[1]

3）克隆型(xing)差異基因(yin)分析(xi)

對(dui)已鑒定(ding)的(de)(de)(de)(de)免疫細胞(bao)進(jin)行(xing)再(zai)分群分析(xi)，基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)于克(ke)隆型(xing)(xing)分型(xing)(xing)，通過分析(xi)不同克(ke)隆型(xing)(xing)亞型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)特征(zheng)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，揭示每個克(ke)隆型(xing)(xing)獨特的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)表達模(mo)式(shi)，進(jin)行(xing)功能富集(ji)分析(xi)，解析(xi)具有(you)不同克(ke)隆型(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)免疫細胞(bao)激活分化功能機制。對(dui)細胞(bao)亞群或(huo)樣(yang)(yang)本(ben)進(jin)行(xing)共享克(ke)隆型(xing)(xing)和差(cha)異克(ke)隆型(xing)(xing)分析(xi)，查看相同亞群或(huo)不同樣(yang)(yang)本(ben)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)共享或(huo)差(cha)異克(ke)隆型(xing)(xing)分布，找出免疫細胞(bao)亞型(xing)(xing)在不同樣(yang)(yang)本(ben)中(zhong)對(dui)應(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)克(ke)隆型(xing)(xing)，探究clonetype 在不同樣(yang)(yang)本(ben)-細胞(bao)類型(xing)(xing)-分組之間的(de)(de)(de)(de)動(dong)態變(bian)化關(guan)系，對(dui)關(guan)心的(de)(de)(de)(de)克(ke)隆型(xing)(xing)進(jin)行(xing)亞群間的(de)(de)(de)(de)差(cha)異基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)分析(xi)，篩(shai)選挖掘與疾病(bing)或(huo)其他免疫性(xing)狀相關(guan)的(de)(de)(de)(de)候選基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)及(ji)其對(dui)應(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)受(shou)體基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)。

分(fen)析方法(fa)：免疫細(xi)胞亞型共(gong)(gong)享(xiang)克隆型分析、樣本間(jian)共(gong)(gong)享(xiang)克隆型分析、克隆型動態變(bian)化分析、功能(neng)富集分析。

細胞亞群間(jian)共享克隆型分析[2]

多樣本間獨有及共享克隆型分布(bu)[3]

克隆(long)型（可選(xuan)擇某一組 topN 克隆(long)型）樣本(ben)間(jian)變化(hua)桑基圖[4]

4）免(mian)疫細胞亞群(qun)分化轉移分析(xi)

根據研(yan)究(jiu)目的(de)(de)(de)篩(shai)選出目標免(mian)(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)(ya)型(xing)，通過(guo)功能(neng)富集分析研(yan)究(jiu)亞(ya)(ya)型(xing)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)功能(neng)，最終(zhong)篩(shai)選出具(ju)有(you)克隆(long)型(xing)擴張程(cheng)(cheng)度較強(qiang)的(de)(de)(de)亞(ya)(ya)型(xing)。利用(yong)擬時(shi)分析對(dui)目標亞(ya)(ya)型(xing)構建細(xi)(xi)胞(bao)(bao)軌(gui)跡，解(jie)析亞(ya)(ya)型(xing)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)轉移(yi)狀態(tai)，在(zai)每個軌(gui)跡中(zhong)提取具(ju)有(you)相同(tong)克隆(long)型(xing)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，使用(yong) RNA 速率和擬時(shi)分析研(yan)究(jiu)不同(tong)軌(gui)跡的(de)(de)(de)方向性，從而最終(zhong)確(que)定它們(men)的(de)(de)(de)轉移(yi)方向和過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)狀態(tai)，了(le)解(jie)免(mian)(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)免(mian)(mian)疫反應過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)的(de)(de)(de)動(dong)態(tai)變化，以及這些(xie)變化與(yu) TCR/BCR 克隆(long)型(xing)變化之間(jian)的(de)(de)(de)關系(xi)。

分析方法：功能富集分(fen)(fen)析、擬時分(fen)(fen)析、 RNA 速率分(fen)(fen)析

GO\KEGG功能富集分析

擬時序軌跡分析

RNA速率分(fen)析[2]

四、應用案例(li)思(si)路

案例1：構建(jian)免疫細胞圖譜

題目：A blueprint for tumor-infiltrating B cells across human cancers

中文題目：人類癌癥中腫瘤浸潤B細胞的藍圖

期刊：Science

影(ying)響因子：44.5

研(yan)究背景：

在(zai)腫(zhong)(zhong)瘤免疫(yi)過程中，腫(zhong)(zhong)瘤浸潤性B細(xi)胞在(zai)腫(zhong)(zhong)瘤免疫(yi)過程中扮演著重要(yao)的角色。這些B細(xi)胞表現出多(duo)種功(gong)能(neng)，主要(yao)是通過它(ta)們(men)分化為漿細(xi)胞產(chan)生(sheng)抗體的能(neng)力(li)，但(dan)在(zai)不(bu)同的癌(ai)癥(zheng)(zheng)類(lei)型中，它(ta)們(men)在(zai)時空上(shang)存在(zai)差異。解剖不(bu)同癌(ai)癥(zheng)(zheng)類(lei)型中B細(xi)胞的豐度和分化狀態有望改善免疫(yi)治療反應。

研究思路：

研(yan)究(jiu)結論：

1. 該研(yan)(yan)究繪制(zhi)了跨20種人(ren)類癌癥的腫瘤浸潤B細(xi)胞藍圖(tu)，揭(jie)示其異(yi)質性及(ji)兩條動(dong)態分化途徑(jing)，為后續(xu)研(yan)(yan)究提供基礎(chu)參考。

2. 發(fa)現腫(zhong)瘤中存在(zai)生發(fa)中心（GC）和非(fei)生發(fa)中心（EF）兩條ASC分化(hua)途徑，且(qie)不(bu)同(tong)癌癥類型對(dui)二者有偏好，EF途徑主導的癌癥與(yu)不(bu)良臨床(chuang)結果(guo)相關。

3. 明確了(le)調(diao)控(kong)B細(xi)(xi)胞分化(hua)的(de)轉錄因(yin)子(zi)及表觀遺傳網絡，不同途徑相關(guan)的(de)B細(xi)(xi)胞亞群有(you)特定的(de)調(diao)控(kong)模式和(he)表觀遺傳特征。

4. 表(biao)明EF途徑(jing)中(zhong)的AtM B細(xi)胞具有(you)耗竭和(he)旁觀者表(biao)型，獨立于GC途徑(jing)發育，在空間上(shang)與(yu)T細(xi)胞相(xiang)互作用(yong)，對T細(xi)胞功能有(you)影(ying)響。

5. 證實谷氨酰(xian)胺(an)代(dai)謝通過影響表觀遺傳(chuan)修(xiu)飾建立AtM B細胞(bao)(bao)的身份，且EF途徑相關的B細胞(bao)(bao)與免(mian)疫抑制微環境和不良預后相關，為B細胞(bao)(bao)靶向免(mian)疫療法提供(gong)思路。

案(an)例2：腫瘤免疫機制研究

題目：Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy

中(zhong)文題目：癌癥免(mian)疫療法誘導結腸炎(yan)癥的(de)分子途(tu)徑(jing)

期刊(kan)：Cell.

影響因子：45.5

研究背景：

靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1通路的單克隆抗體(ti)—免疫檢查點抑制劑（CPI）治療(liao)可(ke)在多(duo)種人類惡性(xing)腫瘤(liu)中(zhong)誘導持久反應，但也會誘導炎癥(zheng)毒性(xing)，統稱為免疫相關不良事(shi)件（irAEs）。然而(er)，導致這些嚴重炎癥(zheng)副(fu)作(zuo)用的免疫機(ji)制仍然知之甚少。

研究思路：

研究結論：

1. CPI結腸炎患者免疫細胞(bao)組成改變(bian)，CD8 T細胞(bao)毒性與增(zeng)殖(zhi)增(zeng)強(qiang)，CD4 T細胞(bao)亞群變(bian)化(hua)且Tregs未耗竭，髓(sui)系細胞(bao)頻率增(zeng)加(jia)且基因表達改變(bian)。

2. 結腸炎(yan)相(xiang)關CD8 T細胞簇(cu)與組織駐留(liu)記憶(yi)T細胞簇(cu)在(zai)TCR克(ke)隆型上存在(zai)動態聯(lian)系，提示分化軌跡。

3. 相關T細(xi)胞簇中(zhong)抑制性受體及細(xi)胞因子相關基因表(biao)達變化，體現免疫細(xi)胞功能(neng)狀態及IFNγ的(de)重要作用(yong)。

4. 發現多個潛在治(zhi)(zhi)療靶點，如(ru)趨化因子(zi)相關分子(zi)和細胞因子(zi)等，為CPI結腸炎治(zhi)(zhi)療提供(gong)方(fang)向。

案例3：抗體(ti)篩選

題目(mu)：Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients' B Cells

中文題目：通過對恢復期患(huan)者 B 細(xi)胞(bao)進行(xing)高(gao)通量單細(xi)胞(bao)測(ce)序(xu)鑒定出針(zhen)對 SARS-CoV-2 的強(qiang)效中(zhong)和(he)抗體(ti)

期刊(kan)：Cell

影響(xiang)因子：45.5

研究背景：

COVID - 19 大流行急需(xu)有(you)效(xiao)的(de)治療和預(yu)防干預(yu)措施(shi)。SARS - CoV - 2 的(de)刺突（S）糖蛋白介導病毒進入宿(su)主細(xi)(xi)胞，其受(shou)體(ti)(ti)結(jie)合(he)域（RBD）與宿(su)主細(xi)(xi)胞的(de) ACE2 受(shou)體(ti)(ti)結(jie)合(he)。康(kang)復(fu)(fu)患(huan)(huan)者(zhe)血漿中(zhong)的(de)中(zhong)和抗體(ti)(ti)對(dui)治療 COVID - 19 有(you)一定(ding)效(xiao)果(guo)，但血漿大規模生產受(shou)限(xian)。從(cong)(cong)康(kang)復(fu)(fu)患(huan)(huan)者(zhe)記憶 B 細(xi)(xi)胞中(zhong)分離中(zhong)和性單克隆抗體(ti)(ti)（mAbs）具有(you)治療潛(qian)力(li)，但傳統篩選(xuan)方法耗(hao)時費力(li)。本研究旨在(zai)應用高(gao)通量單細(xi)(xi)胞 RNA 和 VDJ 測序(xu)技術，快速高(gao)效(xiao)地從(cong)(cong)康(kang)復(fu)(fu)患(huan)(huan)者(zhe)中(zhong)鑒定(ding) SARS - CoV - 2 中(zhong)和抗體(ti)(ti)。

研究(jiu)思路(lu)：

研究結論：

1. 運用高通量單細胞測序技術，從(cong)COVID - 19康復患(huan)者中鑒定出(chu)14種強(qiang)效(xiao)SARS - CoV - 2中和(he)抗體，其中BD - 368 - 2效(xiao)力最強(qiang)。

2. BD - 368 - 2在hACE2轉基因小鼠(shu)模型中(zhong)展現出高治療和(he)預防功效，能改善感染(ran)小鼠(shu)生(sheng)理狀況并降低病毒(du)載量。

3. 解(jie)析中和(he)抗體(ti)BD - 23 - Fab與S三聚體(ti)刺突蛋白的結(jie)構(gou)，發現其通過競(jing)爭抑制ACE2 - RBD結(jie)合來中和(he)病毒(du)，為篩選提供參考。

4. 基于CDR3H結構(gou)相(xiang)似性篩選出部分(fen)中和抗體(ti)，提(ti)示可能存在針對SARS - CoV - 2特定(ding)表(biao)位的刻板型B細胞受體(ti)，為抗體(ti)療法(fa)提(ti)供(gong)思(si)路(lu)。

參考文獻：

[1] Yang H Q , Wang Y S , Zhai K ,et al.Single-Cell TCR Sequencing Reveals the Dynamics of T Cell Repertoire Profiling During Pneumocystis Infection[J].Frontiers in Microbiology, 2021, 12:637500-.DOI:10.3389/fmicb.2021.637500.

[2]Luoma AM, Suo S, Williams HL, et al. Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy. Cell. 2020;182(3):655-671.e22. doi:10.1016/j.cell.2020.06.001.

[3]Wang P,Jin X,Zhou W,et al.Comprehensive analysis of TCR repertoire in COVID-19 using single cell sequencing[J].Genomics, 2020, 113(2).DOI:10.1016/j.ygeno.2020.12.036.

[4]Borcherding N , Vishwakarma A , Voigt A P ,et al.Mapping the immune environment in clear cell renal carcinoma by single-cell genomics[J].Communications Biology, 2021, 4(122).DOI:10.1038/s42003-020-01625-6