空間(jian)轉錄組(zu)學正在(zai)徹(che)底(di)改變我們對(dui)發育生(sheng)物(wu)學、腫(zhong)瘤學和(he)(he)疾病(bing)病(bing)理學的(de)理解(jie)，它能夠(gou)在(zai)原(yuan)生(sheng)組(zu)織環境中(zhong)繪制復雜的(de)基因(yin)(yin)表(biao)達(da)模(mo)式。然而，目前該領域的(de)研究主(zhu)要集(ji)中(zhong)在(zai)信(xin)使RNA（mRNA）表(biao)達(da)的(de)分析(xi)(xi)上。真核(he)細胞的(de)轉錄組(zu)包(bao)(bao)含各種動(dong)態和(he)(he)多樣(yang)的(de)RNA分子，不僅包(bao)(bao)括編(bian)碼蛋白質合成的(de)成熟(shu)mRNA，還包(bao)(bao)括RNA可變剪接體、小(xiao)RNA和(he)(he)其他具有(you)調控功能的(de)非編(bian)碼RNA。因(yin)(yin)此，對(dui)不同種類的(de)RNA分子在(zai)其生(sheng)命(ming)周期中(zhong)的(de)空間(jian)分析(xi)(xi)對(dui)于解(jie)析(xi)(xi)復雜組(zu)織中(zhong)的(de)RNA生(sheng)物(wu)學全貌(mao)至關重要。

此(ci)外，在臨床(chuang)實踐中(zhong)，福爾馬林固定石蠟(la)包埋（Formalin-fixed Paraffin-embedded，FFPE）組織(zhi)是病理學(xue)診斷(duan)的(de)(de)基石。全世界的(de)(de)臨床(chuang)病理科積累了大量FFPE組織(zhi)塊(kuai)，這些材料與詳細的(de)(de)臨床(chuang)數據(ju)相結合(he)，構成了尚未充分(fen)利(li)用的(de)(de)人體生物學(xue)和轉(zhuan)化研究(jiu)的(de)(de)寶貴資源。然而(er)，FFPE樣本(ben)也帶來(lai)了特定挑戰。在石蠟(la)包埋過程中(zhong)，樣本(ben)中(zhong)的(de)(de)RNA高(gao)度片段化，并且在室溫儲存條件下進一步降(jiang)解。因(yin)此(ci)，對(dui)臨床(chuang)級FFPE樣本(ben)中(zhong)的(de)(de)RNA分(fen)子進行空間分(fen)析極(ji)為(wei)困難。

2024年9月30日，來自(zi)耶魯大(da)學樊榮團隊的(de)(de)研究(jiu)人員在(zai)Cell發表(biao)(biao)了(le)題(ti)為“Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues”的(de)(de)研究(jiu)論文(wen)。該平(ping)臺巧妙地利用FFPE樣本(ben)中自(zi)然(ran)發生的(de)(de)RNA片(pian)段(duan)化，向廣泛多樣的(de)(de)RNA分子(zi)原位添加poly(A)尾，結(jie)合微流控條(tiao)形碼標(biao)記和算法(fa)創新(xin)，成(cheng)功實現了(le)對臨床存檔FFPE組(zu)織(zhi)(zhi)的(de)(de)全(quan)覆蓋、逐堿基的(de)(de)空間(jian)全(quan)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)。Patho-DBiT通過對完整mRNA、缺失(shi)poly(A)尾的(de)(de)片(pian)段(duan)化mRNA、各類(lei)大(da)/小非編碼RNA、剪接異(yi)構(gou)體以及(ji)攜(xie)帶單核苷酸變(bian)異(yi)（SNV）的(de)(de)前體RNA進行空間(jian)條(tiao)形碼標(biao)記，精確解碼了(le)FFPE復(fu)雜組(zu)織(zhi)(zhi)中豐(feng)富的(de)(de)RNA生物(wu)學信息，包括單細胞級mRNA圖譜、非編碼RNA表(biao)(biao)達、可變(bian)剪接、遺傳(chuan)變(bian)異(yi)、microRNA調控及(ji)RNA動態變(bian)化等。

技術(shu)原理

Patho-DBIT技(ji)術利(li)用(yong)FFPE樣(yang)本中自(zi)然(ran)發生的(de)RNA片(pian)段(duan)化(hua)(hua)過程(cheng)(cheng)。在(zai)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)切片(pian)制備過程(cheng)(cheng)中，樣(yang)本中的(de)RNA經歷不同(tong)程(cheng)(cheng)度(du)的(de)片(pian)段(duan)化(hua)(hua)。通過向這(zhe)(zhe)些片(pian)段(duan)化(hua)(hua)的(de)RNA分(fen)子(zi)原位(wei)添加(jia)poly(A)尾，增(zeng)強了這(zhe)(zhe)些RNA分(fen)子(zi)的(de)標記和穩定(ding)性，使(shi)其(qi)能(neng)(neng)夠(gou)(gou)在(zai)后(hou)續步驟中進(jin)行有效的(de)測(ce)序。通過微流控(kong)技(ji)術，Patho-DBIT能(neng)(neng)夠(gou)(gou)在(zai)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)樣(yang)本中以極高的(de)分(fen)辨率（可達(da)100×100的(de)網格）進(jin)行條(tiao)形(xing)(xing)碼標記。每個標記的(de)RNA分(fen)子(zi)都被(bei)賦予一個獨(du)特的(de)條(tiao)形(xing)(xing)碼，用(yong)于后(hou)續的(de)空間定(ding)位(wei)和數據(ju)分(fen)析（圖(tu)1）。結合創新的(de)算法，Patho-DBIT能(neng)(neng)夠(gou)(gou)精確(que)解碼FFPE組(zu)(zu)(zu)織(zhi)樣(yang)本中豐(feng)富(fu)的(de)RNA生物學信息，包括(kuo)完整的(de)mRNA、片(pian)段(duan)化(hua)(hua)mRNA、非編(bian)碼RNA、剪(jian)接異構體以及(ji)(ji)攜帶(dai)單核苷酸變(bian)(bian)異（SNV）的(de)前(qian)體RNA，從而精準解碼FFPE復雜(za)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)中的(de)豐(feng)富(fu)RNA生物學信息，包括(kuo)單細胞級mRNA表(biao)達(da)譜(pu)、非編(bian)碼RNA表(biao)達(da)、可變(bian)(bian)剪(jian)接、遺傳變(bian)(bian)異、microRNA調控(kong)以及(ji)(ji)RNA動態(tai)變(bian)(bian)化(hua)(hua)等。

圖(tu)1 Patho-DBiT技術(shu)流程及全場景(jing)空間分析能力(li)

研究內容

1、小鼠(shu)胚胎Patho-DBiT設(she)計及空(kong)間全轉(zhuan)錄(lu)組(zu)定位(wei)

研(yan)究中使用50 mm像(xiang)素(su)大(da)小的(de)(de)(de)裝置將(jiang)Patho-DBiT應用于E13小鼠胚胎FFPE切片。無監(jian)督聚類顯示(shi)了20個(ge)(ge)轉錄組簇，空間UMAP與(yu)H&E染色的(de)(de)(de)相(xiang)鄰切片的(de)(de)(de)組織學(xue)緊密一致。Patho-DBiT平均(jun)每像(xiang)素(su)檢測到5,480個(ge)(ge)基因和15,381個(ge)(ge)獨特(te)的(de)(de)(de)分子標(biao)識(shi)符（UMIs），全基因組泛mRNA和UMI圖譜顯示(shi)出與(yu)組織形態和密度(du)的(de)(de)(de)強烈一致性。在相(xiang)鄰切片上進行的(de)(de)(de)重復重復性非常高。

圖2 Patho-DBiT在(zai)E13小(xiao)鼠胚胎(tai)切片上的表現(xian)

2、小鼠大腦中區域特(te)異(yi)性替代剪接(jie)和(he)A-to-I RNA編輯的(de)空間(jian)共譜(pu)分析

研(yan)究團隊在不(bu)同組(zu)織(zhi)類(lei)型和(he)空間(jian)分(fen)(fen)(fen)辨率(lv)下對Patho-DBiT進行(xing)了充分(fen)(fen)(fen)驗證。在小鼠(shu)腦(nao)冠(guan)狀切(qie)片的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)析中(zhong)，Patho-DBiT在50 μm的(de)(de)(de)(de)空間(jian)像(xiang)素中(zhong)平均(jun)檢(jian)測到6786個(ge)基(ji)因和(he)31063個(ge)獨特分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)標(biao)記（UMI）。聚(ju)類(lei)分(fen)(fen)(fen)析精確重構(gou)了大(da)腦(nao)組(zu)織(zhi)的(de)(de)(de)(de)解(jie)剖結(jie)構(gou)，其(qi)空間(jian)排列與Allen小鼠(shu)大(da)腦(nao)圖譜上相(xiang)似(si)切(qie)片的(de)(de)(de)(de)區(qu)域注釋高度一致。此外(wai)，Patho-DBiT捕獲(huo)(huo)了調控大(da)腦(nao)重要功能的(de)(de)(de)(de)基(ji)因及其(qi)區(qu)域性剪(jian)接(jie)(jie)異構(gou)體的(de)(de)(de)(de)表達，以至(zhi)少(shao)需要2個(ge)剪(jian)接(jie)(jie)連(lian)接(jie)(jie)跨(kua)越(yue)讀數(shu)（splice-junction-spanning read counts）為(wei)標(biao)準(zhun)，研(yan)究人(ren)員在2,368個(ge)基(ji)因中(zhong)共檢(jian)測到3,879個(ge)不(bu)同的(de)(de)(de)(de)可變剪(jian)接(jie)(jie)事件，包括外(wai)顯子(zi)(zi)(zi)跳躍（SE）、內含子(zi)(zi)(zi)保留(liu)（RI）、3'選(xuan)擇(ze)(ze)性剪(jian)接(jie)(jie)位點(dian)(dian)（A3SS）、5'選(xuan)擇(ze)(ze)性剪(jian)接(jie)(jie)位點(dian)(dian)（A5SS）和(he)外(wai)顯子(zi)(zi)(zi)互(hu)斥(chi)（MXE）等，其(qi)空間(jian)分(fen)(fen)(fen)布與一套獨立的(de)(de)(de)(de)、通過長讀長納米孔測序獲(huo)(huo)得(de)的(de)(de)(de)(de)新鮮(xian)冷凍腦(nao)樣本(ben)數(shu)據(ju)相(xiang)吻(wen)合(he)。

圖(tu)3 小鼠(shu)腦基因表(biao)達和RNA加(jia)工的空間共定位

3、Patho-DBiT概述了臨床檔案AITL樣本的(de)淋巴瘤(liu)發生生物學

接(jie)下來，作者(zhe)將(jiang)空間(jian)分(fen)析擴展到臨床(chuang)存檔的FFPE 組織(zhi)。無監(jian)督聚類揭示了(le)(le)10個空間(jian)組織(zhi)簇與(yu)組織(zhi)學結構對齊(qi)，UMAP平(ping)均包含5364個基因(yin)，每像(xiang)素11989個UMAP，描(miao)述了(le)(le)標準標記定義的不同細(xi)(xi)胞類型(xing)。為了(le)(le)評估這(zhe)種長(chang)期儲存的FFPE切片的捕獲準確性(xing)，研(yan)究團隊使用索引共檢(jian)測（CODEX）法對相鄰(lin)組織(zhi)切片進行了(le)(le)高復(fu)雜(za)性(xing)空間(jian)細(xi)(xi)胞分(fen)型(xing)。

接下來，作者將(jiang)空間分(fen)析擴展到臨床存檔的(de)(de)FFPE組織(zhi)(zhi)。使(shi)用(yong)Patho-DBiT對(dui)一名診斷為(wei)血(xue)管免疫(yi)母細胞(bao)T細胞(bao)淋巴瘤（AITL）的(de)(de)患者皮下結節(jie)獲得的(de)(de)組織(zhi)(zhi)切片進行條形碼（圖4）。這個嵌(qian)塊在(zai)進行實驗之前，已(yi)經(jing)在(zai)室溫下保存了(le)(le)5年多。無監督(du)聚類(lei)(lei)顯示了(le)(le)10個空間組織(zhi)(zhi)的(de)(de)聚類(lei)(lei)與組織(zhi)(zhi)學結構對(dui)齊。UMAP平均每像素有5364個基因和(he)11989個UMIs，描述了(le)(le)由典型標(biao)記定義的(de)(de)不同細胞(bao)類(lei)(lei)型。為(wei)了(le)(le)評估這個長期存儲的(de)(de)FFPE切片的(de)(de)捕獲準(zhun)確(que)性，我們使(shi)用(yong)索引（CODEX）共檢測(ce)對(dui)相(xiang)鄰組織(zhi)(zhi)切片進行了(le)(le)高倍空間細胞(bao)分(fen)型。增殖標(biao)志物(wu)MKI67和(he)PDCD1經(jing)常在(zai)惡性AITL細胞(bao)上表達，在(zai)本切片中呈致(zhi)密的(de)(de)結節(jie)狀分(fen)布，與CODEX鑒定一致(zhi)。

圖4 儲存5年的AITL樣本的高(gao)靈敏度空間轉(zhuan)錄組學(xue)

4、通過整合擴(kuo)展Patho-DBiT與高(gao)分辨(bian)率(lv)組(zu)織(zhi)(zhi)學的超(chao)分辨(bian)率(lv)組(zu)織(zhi)(zhi)結構

研究團隊(dui)使(shi)用了(le)(le)100×100微流控設備(bei)，以20 μm的(de)像素分辨(bian)率對(dui)(dui)10,000個點(dian)進(jin)(jin)(jin)行條形碼標記，成(cheng)功對(dui)(dui)一(yi)例診斷為黏膜相關淋巴(ba)組織邊緣區淋巴(ba)瘤（MALT）的(de)臨床腫瘤活檢(jian)樣(yang)本進(jin)(jin)(jin)行了(le)(le)空間(jian)解析(xi)。該樣(yang)本已在室(shi)溫下存(cun)放(fang)超過三(san)年。通過Patho-DBiT平臺，團隊(dui)在一(yi)次實驗中獲(huo)得了(le)(le)該樣(yang)本的(de)多(duo)重信(xin)息。對(dui)(dui)基因表達矩陣進(jin)(jin)(jin)行無(wu)監督(du)聚(ju)類(lei)分析(xi)后(hou)，識(shi)別出了(le)(le)20個亞群，這些亞群的(de)空間(jian)分布(bu)與組織學結(jie)構(gou)高度一(yi)致(zhi)。即使(shi)是數量較少的(de)特定細胞類(lei)型(xing)，Patho-DBiT也能夠精(jing)確檢(jian)測，并通過免(mian)疫熒光染(ran)色進(jin)(jin)(jin)一(yi)步(bu)驗證了(le)(le)結(jie)果的(de)可靠性。

圖5 通過(guo)將(jiang)病(bing)理DBiT與(yu)組織(zhi)(zhi)學相結合，解決了高分辨率(lv)的組織(zhi)(zhi)結構問(wen)題

5、用于腫瘤鑒(jian)別的基因組(zu)尺度(du)空間(jian)序列變異分析

序(xu)(xu)列變(bian)異在RNA轉錄(lu)本中很常見，在很大程度上(shang)反映(ying)(ying)(ying)了潛在的基因(yin)突變(bian)或RNA編輯。研究團隊進一(yi)步使用最新開(kai)發(fa)的計算平臺iStar，將分層組(zu)織學圖像特征(zheng)提取與轉錄(lu)組(zu)學數據相(xiang)融合(he)，成功實(shi)現了單(dan)細胞(bao)水平的空(kong)間基因(yin)表達(da)映(ying)(ying)(ying)射，大幅提升了空(kong)間細胞(bao)異質性的解析能力(li)（圖6）。其次，Patho-DBiT能夠(gou)捕獲全(quan)基因(yin)組(zu)范圍內的序(xu)(xu)列變(bian)異，并生成空(kong)間SNV表達(da)矩陣。它無需依賴(lai)已知(zhi)標記物，通過無監督聚類(lei)即可區分腫(zhong)瘤(liu)亞(ya)克隆(long)與非(fei)惡性細胞(bao)，并預測克隆(long)進化(hua)關(guan)系(xi)。此外，該MALT組(zu)織的測序(xu)(xu)數據中有(you)35%的序(xu)(xu)列映(ying)(ying)(ying)射到(dao)了非(fei)編碼RNA，Patho-DBiT捕捉到(dao)了從數十到(dao)數千種不(bu)同非(fei)編碼RNA分子的空(kong)間分布及其與腫(zhong)瘤(liu)發(fa)生的關(guan)系(xi)。

圖6 用于區(qu)分惡性亞克隆(long)的全基因組空(kong)間變異分析

總(zong) 結

Patho-DBiT技術具(ju)(ju)有廣泛應用性(xing)，不僅可(ke)(ke)(ke)用于小RNA和(he)miRNA的(de)(de)空(kong)間表達譜(pu)，還可(ke)(ke)(ke)用于探(tan)索RNA后轉(zhuan)錄修(xiu)飾與空(kong)間基(ji)(ji)因(yin)(yin)表達模式。它展現了(le)從(cong)冷凍(dong)組織到(dao)陳舊(jiu)FFPE樣(yang)本的(de)(de)兼容性(xing)。此外，在(zai)FFPE樣(yang)本上(shang)具(ju)(ju)有巨大(da)潛力，該技術在(zai)FFPE樣(yang)本上(shang)展示了(le)極高的(de)(de)空(kong)間分辨率，為(wei)過去的(de)(de)病理樣(yang)本提供(gong)了(le)重(zhong)要的(de)(de)分析(xi)機會。例如(ru)，在(zai)分析(xi)5年儲(chu)存的(de)(de)AITL樣(yang)本和(he)3年儲(chu)存的(de)(de)MALT組織時，該技術展示了(le)對基(ji)(ji)因(yin)(yin)表達、基(ji)(ji)因(yin)(yin)組突變、小RNA網絡和(he)剪接動態的(de)(de)多層次分析(xi)。未(wei)來在(zai)臨床(chuang)的(de)(de)應用中，Patho-DBiT可(ke)(ke)(ke)深(shen)入(ru)了(le)解不同(tong)腫瘤細胞(bao)在(zai)不同(tong)微環境(jing)中的(de)(de)存活機制，幫(bang)助識(shi)別病變進展和(he)耐藥性(xing)的(de)(de)特(te)(te)(te)定(ding)癌細胞(bao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)型或克隆型。這可(ke)(ke)(ke)能(neng)幫(bang)助個(ge)體(ti)化(hua)治療方案的(de)(de)制定(ding)，如(ru)探(tan)索特(te)(te)(te)定(ding)藥物（如(ru)ROCK1抑(yi)制劑）對特(te)(te)(te)定(ding)患(huan)者的(de)(de)潛在(zai)療效(xiao)。