2024-11-18
文章題目：High-throughput profiling of antibiotic resistance gene dynamic in a drinking water river-reservoir system
期(qi)刊：Water Research
發表時間：2019年2月
●●● 研究背(bei)景(jing) ●●●
抗(kang)生(sheng)素(su)耐(nai)藥性及其相關(guan)(guan)基因（ARGs）的(de)(de)日(ri)益增(zeng)加與(yu)傳播，已成為21世(shi)紀全球公共衛生(sheng)領(ling)域的(de)(de)一大(da)嚴峻挑(tiao)戰。值得注(zhu)意的(de)(de)是，抗(kang)生(sheng)素(su)耐(nai)藥性的(de)(de)存在(zai)并(bing)非新近現象(xiang)，而是一個古(gu)老且(qie)自(zi)然(ran)(ran)的(de)(de)過(guo)程。然(ran)(ran)而，自(zi)1942年(nian)(nian)青(qing)霉素(su)首次應用(yong)(yong)于臨床(chuang)以來，由于現代抗(kang)生(sheng)素(su)的(de)(de)過(guo)度使用(yong)(yong)和(he)不(bu)當應用(yong)(yong)，導致ARGs的(de)(de)快(kuai)速演化(hua)與(yu)廣(guang)泛(fan)擴散。河流(liu)生(sheng)態(tai)系統(tong)尤其容易受(shou)(shou)(shou)到(dao)(dao)人類活(huo)動的(de)(de)影響(xiang)，例如畜牧業(ye)、農業(ye)和(he)城市污水(shui)(shui)(shui)排(pai)放(fang)等，均會將各類化(hua)學與(yu)生(sheng)物污染物引入河流(liu)領(ling)域。最新研究(jiu)表(biao)明，我國每年(nian)(nian)大(da)約有24,748噸抗(kang)生(sheng)素(su)及9.47×10^13個ARGs單(dan)位/人/日(ri)被排(pai)入河流(liu)及其相連的(de)(de)水(shui)(shui)(shui)體(ti)之中(zhong)。相比之下，多數水(shui)(shui)(shui)庫(ku)地(di)處(chu)偏遠(yuan)且(qie)未(wei)受(shou)(shou)(shou)嚴重干擾(rao)的(de)(de)自(zi)然(ran)(ran)環境中(zhong)，除了接(jie)收來自(zi)上游河流(liu)的(de)(de)來水(shui)(shui)(shui)之外，基本(ben)不(bu)會受(shou)(shou)(shou)到(dao)(dao)其他類型的(de)(de)人為活(huo)動影響(xiang)，因而常被視為關(guan)(guan)鍵的(de)(de)飲(yin)用(yong)(yong)水(shui)(shui)(shui)源(yuan)地(di)。因此(ci)，在(zai)抗(kang)生(sheng)素(su)與(yu)ARGs污染程度上，水(shui)(shui)(shui)庫(ku)水(shui)(shui)(shui)體(ti)通常比河流(liu)系統(tong)要低得多，顯示出更好(hao)的(de)(de)水(shui)(shui)(shui)質狀況。
以往的(de)(de)(de)(de)(de)研究主要(yao)集中(zhong)在(zai)河(he)流(liu)、水庫、河(he)口以及(ji)人工水體(ti)中(zhong)抗性(xing)(xing)(xing)基因(yin)（ARGs）的(de)(de)(de)(de)(de)出現與分布情況。盡(jin)管(guan)河(he)流(liu)-水庫系統(tong)在(zai)生態上的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)性(xing)(xing)(xing)已得到(dao)廣(guang)泛認同(tong)，但關于(yu)這(zhe)(zhe)一(yi)系統(tong)中(zhong)ARGs的(de)(de)(de)(de)(de)具體(ti)分布特(te)征，仍缺(que)乏足(zu)夠的(de)(de)(de)(de)(de)研究。值得注意的(de)(de)(de)(de)(de)是，現有(you)的(de)(de)(de)(de)(de)文獻雖然總結(jie)了影(ying)響(xiang)不同(tong)環境(jing)ARG動態的(de)(de)(de)(de)(de)關鍵因(yin)素(su)，但在(zai)某些(xie)方(fang)面結(jie)論尚存分歧。此(ci)外，關于(yu)這(zhe)(zhe)些(xie)因(yin)素(su)如何具體(ti)影(ying)響(xiang)ARGs的(de)(de)(de)(de)(de)研究，特(te)別是基于(yu)實地數據的(de)(de)(de)(de)(de)研究，依然相當稀缺(que)。因(yin)此(ci)，對(dui)河(he)流(liu)-水庫系統(tong)內ARGs的(de)(de)(de)(de)(de)譜型及(ji)其(qi)影(ying)響(xiang)因(yin)素(su)進行全面調查至(zhi)關重(zhong)要(yao)。這(zhe)(zhe)不僅有(you)助(zhu)于(yu)深化我們(men)對(dui)自然水體(ti)中(zhong)ARGs行為模(mo)式的(de)(de)(de)(de)(de)理解(jie)，填補現有(you)的(de)(de)(de)(de)(de)知識空白，更為應對(dui)日益嚴(yan)峻(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)抗生素(su)耐藥性(xing)(xing)(xing)挑戰提供了科學(xue)依據，助(zhu)力(li)制定有(you)效的(de)(de)(de)(de)(de)管(guan)理措施。
●●● 研究思路 ●●●
選址(zhi)和(he)取樣(yang)：亞(ya)熱(re)帶河流-水(shui)庫系(xi)統中進行樣(yang)本(ben)采集(ji)(ji)，覆(fu)蓋流域面積5150 km2。這(zhe)一(yi)水(shui)系(xi)位于人口(kou)密集(ji)(ji)區域，由兩條主要(yao)支流構成，正(zheng)面臨嚴重的非點(dian)源(yuan)污染問題，包(bao)括但不限(xian)于工業廢(fei)水(shui)排放(fang)、畜(chu)牧業廢(fei)水(shui)以及(ji)農業徑(jing)流。這(zhe)些污染物(wu)最(zui)終匯入一(yi)個(ge)(ge)位于較為原始地(di)帶的大型深水(shui)庫。總體而言，本(ben)研究探討的環境梯度涵(han)蓋了從(cong)河流到水(shui)庫水(shui)系(xi)間水(shui)文條件的變化及(ji)人類活動強度的不同，這(zhe)一(yi)現象在其他流域中也普遍存(cun)在。調(diao)查分(fen)別在三個(ge)(ge)季節開展，從(cong)8個(ge)(ge)不同采樣(yang)點(dian)收集(ji)(ji)地(di)表(biao)水(shui)、中層水(shui)和(he)底(di)水(shui)，制成復(fu)合樣(yang)本(ben)。所有樣(yang)本(ben)在分(fen)析前(qian)即刻(ke)送往實驗(yan)室，并(bing)在4oC的條件下保(bao)存(cun)。
DNA提取與(yu)處(chu)理：使用EZNATM Soil and EZNATM Water DNA Kits (OMEGA, USA)試劑盒，然后將合格的(de)DNA調整至50 ng/μL，保存于- 80oC
QPCR芯片：Wafergen SmartChip Real-time PCR system 用于(yu)熒光(guang)定(ding)量分析。296對(dui)引物使用于(yu)本研究(jiu)中(zhong)，其中(zhong)包(bao)括285個(ge)抗生素類的(de)ARGs、9個(ge)MGEs（8個(ge)轉座酶,1個(ge)通用的(de)I類整(zheng)合(he)子整(zheng)合(he)酶基(ji)因(yin)(yin) cintI-1 ）、1個(ge)臨床I類整(zheng)合(he)子整(zheng)合(he)酶基(ji)因(yin)(yin) intI-1和16S rRNA基(ji)因(yin)(yin)。基(ji)因(yin)(yin)拷貝數按下式(shi)計算。Gene Copy Number = 10(31?Ct)/(10/3)。為(wei)了保證數據的(de)準確(que)性與可靠性，所有樣本均進行了三次技術重復。
同(tong)時，研(yan)究細菌(jun)16S rRNA基因測序(xu)。測定水(shui)樣中溶解有(you)機碳，溶解總氮（DTN）和總磷（DTP）含量。基于對中國抗生素使用(yong)情(qing)況(kuang)的調(diao)研(yan)，選取了(le)17種代表性的抗生素作為靶化合物，包括磺胺(an)嘧啶(ding)（SDZ）、磺胺(an)甲氧嘧啶(ding)（SMM）和磺胺(an)喹(kui)啉（SQX）等。
●●● 數(shu)據分析 ●●●
Fig 1. (A) 在(zai)河流與(yu)水(shui)(shui)庫(ku)水(shui)(shui)系采集的(de)水(shui)(shui)樣(yang)中(zhong)，檢(jian)測到(dao)的(de)ARGs和MGEs（在(zai)亞型水(shui)(shui)平上(shang)）的(de)數量(liang)。根據ARGs產(chan)生耐藥(yao)性的(de)抗生素進行分類(lei)：氨基(ji)糖苷類(lei)、β -內(nei)酰(xian)胺酶、氯霉素、大環內(nei)酯-林可酰(xian)胺類(lei)-鏈霉素B （MLSB）、多(duo)藥(yao)磺胺類(lei)、四環素、萬古霉素或其他。(B) 維(wei)恩(en)圖展示(shi)了河流系統與(yu)水(shui)(shui)庫(ku)系統間共有及(ji)獨有ARGs數量(liang)。河水(shui)(shui)（n = 24）；水(shui)(shui)庫(ku)（n = 15）。
Fig 2. 16S rRNA （A和D）、ARGs （B和E）和MGEs （C和F）不同(tong)季節與環境梯度下絕對豐度變化(hua)。采用Kruskal-Wallis檢驗確定對變異檢驗的顯(xian)著影響(xiang)（*:P < 0.05, **:P < 0.05）。
Fig 3. (A) 河(he)(he)流水(shui)系(xi)和(he)水(shui)庫水(shui)系(xi)的(de)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)濃(nong)度。(B)河(he)(he)流水(shui)系(xi)和(he)水(shui)庫水(shui)系(xi)中(zhong)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)濃(nong)度與各類ARGs、MGEs和(he)intI-1絕對(dui)豐度之(zhi)間的(de)Pearson相(xiang)關性(xing)。右下為(wei)相(xiang)關系(xi)數的(de)色帶指標（*:P < 0.05, **: P < 0.01）。白框表示(shi)各參(can)數間無顯著相(xiang)關性(xing)（P > 0.05）。∑ARGs：ARGs總(zong)和(he)。∑Antibiotics：抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)總(zong)和(he)。
●●● 總結 ●●●
降(jiang)雨(yu)引發的(de)(de)(de)(de)季節(jie)性(xing)(xing)徑(jing)流(liu)(liu)可(ke)能顯著(zhu)(zhu)影響(xiang)抗性(xing)(xing)基因(yin)(yin)（ARGs）和可(ke)移動遺傳(chuan)元(yuan)件（MGEs）的(de)(de)(de)(de)豐度(du)。然而，河流(liu)(liu)與水庫(ku)系統間存在的(de)(de)(de)(de)環(huan)境(jing)梯(ti)度(du)對ARGs及MGEs的(de)(de)(de)(de)多樣性(xing)(xing)、相對豐度(du)及其分(fen)布(bu)的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)更為深(shen)遠。這些(xie)環(huan)境(jing)梯(ti)度(du)不(bu)僅能夠顯著(zhu)(zhu)改變致病(bing)菌群(qun)落(luo)與非(fei)致病(bing)菌群(qun)落(luo)的(de)(de)(de)(de)分(fen)布(bu)格局，還會影響(xiang)ARGs亞型之間以(yi)及MGEs間的(de)(de)(de)(de)共存模式。結構(gou)方程模型分(fen)析(xi)顯示，在河流(liu)(liu)-水庫(ku)系統中(zhong)，MGEs對抗性(xing)(xing)基因(yin)(yin)譜型的(de)(de)(de)(de)形成(cheng)起著(zhu)(zhu)最關鍵的(de)(de)(de)(de)作用。此外，環(huan)境(jing)梯(ti)度(du)可(ke)能通過調(diao)節(jie)MGEs、抗生(sheng)素(su)濃(nong)度(du)、致病(bing)菌群(qun)落(luo)及非(fei)致病(bing)菌群(qun)落(luo)等(deng)因(yin)(yin)素(su)，進而驅動該系統內抗性(xing)(xing)基因(yin)(yin)譜型的(de)(de)(de)(de)變化。
