2017-04-07
派森(sen)諾生物(wu)對微生物(wu)組rRNA可變區和ITS序(xu)列(lie)的(de)(de)高通量測序(xu)已(yi)取得了(le)(le)一系列(lie)豐(feng)碩的(de)(de)成果(guo)，同時，不(bu)僅如此，我們在(zai)(zai)對微生物(wu)代謝所涉及的(de)(de)特定功能基因的(de)(de)研究(jiu)(jiu)領域也積累(lei)了(le)(le)多年(nian)的(de)(de)豐(feng)富經驗，碩果(guo)累(lei)累(lei)。繼2015年(nian)與廈門大學合作，在(zai)(zai)《FEMS Microbiology Letters》發表好氧不(bu)產氧光合作用細菌的(de)(de)相關研究(jiu)(jiu)成果(guo)之后，近期與南京農業大學再(zai)次合作，在(zai)(zai)《Biology and Fertility of Soils》（最(zui)新影(ying)響(xiang)因子3.069）上發表論文，揭(jie)示了(le)(le)長期施肥耕作對土壤中堿性磷酸(suan)酶代謝菌群的(de)(de)影(ying)響(xiang)。
研究背景
磷元素對植物生長和農作物收益至關重要。在土壤生態系統中，磷元素通常存在于礦物中而難以直接被植物吸收，卻又很容易流失造成水體的富營養化。同時，土壤中30~50%的磷以有機磷的形式存在，只有當其被磷酸酶礦化成無機磷后，才能被植物和土壤微生物吸收和進一步利用。磷酸酶分為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶（Alkaline phosphomonoesterase，ALP），主要由土壤微生物分泌，并在土壤磷元素的代謝循環中起關鍵作用。在堿性磷酸酶家族中，phoD基因被認為是土壤中最重要的堿性磷酸酶基因。農業上，長期施肥耕作將會影響土壤中編碼phoD基因的磷代謝微生物群落發生變化，但是其中的影響和互作關系還尚未被充分研究。
研(yan)究目的(de)
長期施肥將會影響土壤中營養物質的循環及其可用性，為揭示其具體作用方式，本研究探討不同的長期施肥方式對土壤有機磷組分、編碼堿性磷酸酶ALP基因的微生物群落組成以及堿性磷酸酶活性的影響，并比較不同土壤顆粒組分中，編碼phoD基因的微生物群落對不同施肥方式的響應。
研究(jiu)方法
測(ce)序技(ji)術：Illumina MiSeq高(gao)通(tong)量(liang)測(ce)序平臺
測序模式：微生物組phoD基因測序
實驗對象：5種不同處理(li)下的長(chang)期施肥（從1981年起）土壤(rang)
實驗設計(ji)：不施肥(fei)對照組(zu)（CK）、全(quan)礦(kuang)物(wu)肥(fei)組(zu)（NPK）、中劑量有機(ji)肥(fei)和(he)礦(kuang)物(wu)肥(fei)混(hun)合(he)組(zu)（MNPK）、高劑量有機(ji)肥(fei)和(he)礦(kuang)物(wu)肥(fei)組(zu)（HMNPK）、全(quan)有機(ji)肥(fei)組(zu)（M），每(mei)個(ge)(ge)(ge)處理取(qu)3個(ge)(ge)(ge)生物(wu)學重復，共15個(ge)(ge)(ge)樣品，每(mei)份(fen)樣品取(qu)自(zi)地下0~20 cm處的(de)土壤，在每(mei)個(ge)(ge)(ge)點取(qu)10個(ge)(ge)(ge)直徑5cm的(de)樣本并混(hun)合(he)均(jun)勻。
研究(jiu)結(jie)果
對15份土壤樣品進行土壤理化性質分析、堿性磷酸酶活性檢測、phoD基因的定量PCR檢測、phoD基因高通量測序等實驗，并對高通量測序結果進行物種組成和豐度差異比較分析。
不同的(de)施肥處理方式顯(xian)著影響了土壤的(de)理化性質，例如pH值(zhi)在M組和HMNPK組里(li)有所升高，而(er)在NPK、MNPK及CK組都呈下降趨勢。
ALP酶活(huo)檢測(ce)顯示M組里ALP酶活(huo)最(zui)(zui)高，CK組次(ci)之，而在NPK組最(zui)(zui)低。
實時熒光定量PCR檢測phoD基因的結果表明，其變化趨勢與ALP酶的活性類似，M組最高而NPK組最低；在土壤不同組分中，編碼phoD基因的功能菌數量差異明顯，在泥沙組分里（2~63 mm）豐度最多，在粗(cu)砂組分里(li)（200~2000 mm）豐(feng)度最少，且不同土壤組(zu)分中功能菌的(de)相(xiang)對豐(feng)度與施(shi)肥(fei)處理方式(shi)有(you)關(guan)。
編碼phoD基因的功能菌的Alpha多樣性指數分析，M組和CK組的多樣性顯著低于其它三組。
RDA冗余分析結果表明，不同施肥處理組的phoD功能菌（以不同顏色的實心圓圈表示）整體組成差異顯著；紅色箭頭射線代表各類解釋因子和響應變量，射線越長，表明該因素對土壤中phoD功能菌的影響越大，如ALP活性、pH值、土壤EC值、磷元素總量（TP）、可利用磷含量（AP）、不穩定有機磷含量（LPo）、鈣離子濃度（Ca2+）、土壤有機碳濃度（Corg）、溶解有機碳濃度（DOC）等，都和phoD功能菌組成高度相關。
系統發育樹分析顯示，土壤中phoD功能菌的在門水平主要由Actinobacteria和Proteobacteria組成，在屬水平主要包括Actinoplanes、Micromonospora、Streptomyces、Bradyrhizobium、Burkholderia和Lysobacter。
通過結構方程模型可知，phoD功能菌的組成和豐度、以及pH值等因素都能顯著影響ALP活性，并能解釋土壤中ALP酶活98%的變化，而土壤細菌總量、溶解有機碳濃度（DOC）等因素則從中介導了上述影響過程。
總結
本研究打破固有的基于rRNA基因的菌群組成高通量測序思路，通過phoD基因對磷代謝相關的功能菌群進行測序分析，更加準確高效地對編碼堿性磷酸酶的微生物組進行研究，并結合酶活測定、實時熒光定量qPCR等方法，系統揭示了不同施肥處理在長期作用下，對土壤磷代謝微生物群落的影響，從而為農業耕作和土壤管理提供有力的科學根據。
本研究的測(ce)序和數據分析(xi)工作(zuo)由上海派森(sen)諾(nuo)生(sheng)物(wu)科技股份有限公司(si)完(wan)成。
文章(zhang)索引：
Gongwen Luo, Ning Ling, Paolo Nannipieri, Huan Chen, Waseem Raza, Min Wang, Shiwei Guo, Qirong Shen. (2017). Long-term fertilisation regimes affect the composition of the alkaline phosphomonoesterase encoding microbial community of a vertisol and its derivative soil fractions. Biol Fertil Soils. . doi: 10.1007/s00374-017-1183-3
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