2024-11-22
一、凍存組(zu)織抽核（動(dong)物篇）簡(jian)介
在前(qian)幾篇文章中(zhong)，小派向大(da)家介(jie)紹了多種組(zu)(zu)織(zhi)解離的(de)相關方法，但在單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)測序實驗中(zhong)，并不是所有類型(xing)組(zu)(zu)織(zhi)均可(ke)通過(guo)解離的(de)方式(shi)得到完(wan)美的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸(xuan)液，且不同單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)測序平臺對于(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)直徑(jing)也有限(xian)制。比如胰(yi)腺因存在內源性(xing)酶，而導致解離過(guo)程中(zhong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)活性(xing)下降過(guo)快；心肌(ji)及脂肪等(deng)組(zu)(zu)織(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)直徑(jing)過(guo)大(da)無法滿足單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)平臺要求等(deng)。
此外，組(zu)(zu)(zu)織解離(li)對于新鮮程度也有所要求，而如果(guo)進行單細胞核轉錄組(zu)(zu)(zu)測(ce)序，我們便(bian)可避開(kai)上述解離(li)難(nan)點及直徑大小限(xian)制，同(tong)時組(zu)(zu)(zu)織也可以通過低溫凍(dong)(dong)存方式(shi)寄送(song)。接下來小派將以人胰腺癌(ai)，蛙內耳，雞貯(zhu)精腺三(san)種凍(dong)(dong)存組(zu)(zu)(zu)織為(wei)例，向您(nin)展示動物凍(dong)(dong)存組(zu)(zu)(zu)織的單細胞核懸液制備。
二、解(jie)離方案
1.實(shi)驗試劑配置：（1）適(shi)當體(ti)積(ji)裂解液，冰(bing)上預冷(leng)(leng) （2）適(shi)當體(ti)積(ji)清洗(xi)液，冰(bing)上預冷(leng)(leng) （3）適(shi)當體(ti)積(ji)重懸液，冰(bing)上預冷(leng)(leng) （以上試劑均適(shi)量加入RNA酶抑制(zhi)劑）
2.取樣(yang)裂解：將剪(jian)刀鑷子(zi)等放置于(yu)干冰預冷，隨后(hou)鑷子(zi)夾取(qu)凍存管中組(zu)織，置于(yu)含1-2ml裂(lie)解液的(de)離(li)心管中，視組(zu)織大小進行剪(jian)切(qie)，然后(hou)轉移(yi)至玻璃(li)勻漿器中，使用不同直徑(jing)的(de)玻璃(li)棒進行數(shu)次擠壓，冰上靜(jing)置數(shu)分鐘，期(qi)間臺盼藍鏡檢(jian)觀察細胞裂(lie)解程度(du)。
3.終止清洗：鏡檢觀(guan)察到(dao)大量細(xi)胞核被裂解釋放時，即刻加入(ru)3-5ml清洗(xi)液(ye)終止(zhi)裂解，過(guo)篩收集后，4℃ 500×g 離心5 min，棄上清。
4.重懸鏡(jing)檢(jian)：適當體積(ji)重懸(xuan)液進行(xing)重懸(xuan)后(hou)(hou)，臺盼藍鏡(jing)檢觀(guan)察懸(xuan)液背景，若(ruo)碎片數量過(guo)(guo)多，則進行(xing)后(hou)(hou)續(xu)去碎片操作或流式分選；若(ruo)碎片較少，視細胞(bao)核懸(xuan)液狀態決定是否再次清洗；若(ruo)結團率高可過(guo)(guo)20um細胞(bao)篩等。
5.計數鏡檢：熒(ying)光(guang)計數細(xi)胞核懸液后，調(diao)整濃度并結合鏡檢狀態合格即可(ke)。
三、結果(guo)展示
鏡(jing)檢結果
三(san)組樣本鏡檢背(bei)景干(gan)凈(jing)，無明顯(xian)雜質
濃度檢測
胰腺癌組織，濃度1130 個(ge)/ul，總量11萬左右。
雞貯精腺(xian)組織，濃(nong)度1320個(ge)/ul，總量15萬(wan)左右
蛙內耳組織，濃(nong)度(du)772個/ul，總量10萬左右
數據質(zhi)控(kong)
上圖(tu)是(shi)下機數據(ju)cellranger質控結果(guo)，細胞捕獲數及基因數都符合前期需求(qiu)。
