2024-11-24
表觀(guan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)學(xue)是(shi)研究基(ji)(ji)因(yin)(yin)表達調控的(de)重(zhong)要領(ling)域。近年來，隨著(zhu)單細(xi)胞(bao)測序技(ji)術的(de)發展，科學(xue)家(jia)們能夠更深入(ru)地探討細(xi)胞(bao)在不(bu)同(tong)條件下的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)表達及表觀(guan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)變化。特別是(shi)在癌癥研究中，了解藥物如何影響(xiang)腫瘤(liu)細(xi)胞(bao)的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)和表觀(guan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)，對開(kai)發有效的(de)治療方(fang)法(fa)至關重(zhong)要。
在癌癥研(yan)究(jiu)中，表(biao)觀(guan)遺(yi)傳修(xiu)飾(shi)，如(ru)組(zu)(zu)蛋(dan)白修(xiu)飾(shi)和(he)染(ran)色質可(ke)及性，發(fa)揮著關(guan)鍵作用，影響腫(zhong)(zhong)瘤的發(fa)生與發(fa)展。許多(duo)(duo)小分子藥(yao)物通(tong)(tong)過(guo)改變這些表(biao)觀(guan)遺(yi)傳標(biao)記來抑制(zhi)腫(zhong)(zhong)瘤細(xi)(xi)(xi)胞的生長。例如(ru)，BET抑制(zhi)劑（如(ru)JQ1）通(tong)(tong)過(guo)阻止BRD4蛋(dan)白與染(ran)色質結合，從而抑制(zhi)腫(zhong)(zhong)瘤細(xi)(xi)(xi)胞增殖。然而，單一藥(yao)物的治療效果通(tong)(tong)常有(you)限，且腫(zhong)(zhong)瘤細(xi)(xi)(xi)胞易通(tong)(tong)過(guo)多(duo)(duo)種機制(zhi)產生耐藥(yao)性。因此，研(yan)究(jiu)不同小分子藥(yao)物在單細(xi)(xi)(xi)胞水(shui)平上的基(ji)因組(zu)(zu)和(he)表(biao)觀(guan)基(ji)因組(zu)(zu)作用，對(dui)于(yu)設計更(geng)有(you)效的組(zu)(zu)合療法(fa)至關(guan)重要。
2024年7月，北京大學未來技術學院/北京大學-清華大學生命科學聯合中心/北京大學腫瘤醫院/北京大學成都前沿交叉生物技術研究院何愛彬團隊與北京大學國際癌癥研究院/北京大學腫瘤醫院舒紹坤團隊合作在Nature Methods雜志在線發表題為“Single-cell EpiChem jointly measures drug-chromatin binding and multimodal epigenome”的(de)(de)研究論文。該研究提(ti)出(chu)了一種新(xin)的(de)(de)技術——單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)EpiChem（scEpiChem），能夠同時測量小分子藥(yao)(yao)物在(zai)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中的(de)(de)基(ji)(ji)因組(zu)結合位點及其對表觀(guan)基(ji)(ji)因組(zu)的(de)(de)影響。這(zhe)種方法(fa)結合了藥(yao)(yao)物標記和(he)(he)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測序(xu)技術，使研究人(ren)員能夠在(zai)高通量水平上分析(xi)不同藥(yao)(yao)物與細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內基(ji)(ji)因組(zu)和(he)(he)表觀(guan)基(ji)(ji)因組(zu)的(de)(de)相互作(zuo)用，為理(li)解藥(yao)(yao)物作(zuo)用機制(zhi)和(he)(he)開發(fa)新(xin)的(de)(de)抗癌(ai)療法(fa)提(ti)供了新(xin)的(de)(de)工具(ju)。
技術原理
scEpiChem利用編碼的(de)組(zu)合拆分(fen)和pA-Tn5抗(kang)體介導標記來獲得單細胞小分(fen)子結合位點（如圖(tu)1）。具(ju)體實驗流程如下：
（1）輕度固定(ding)透化的(de)細胞和生物(wu)素(su)化小分子(zi)-抗生物(wu)素(su)抗體復合(he)物(wu)一起孵育；
（2）用(yong)6個帶有T5條形碼接頭的protein A-Tn5(PAT-T5)標記細胞，以標記小分子靶(ba)向的特定基(ji)因組區域；
（3）將具(ju)有轉座染色質片段的細胞分配到96孔板(ban)中，與特定的條(tiao)形(xing)碼(ma)寡核苷酸進行兩輪雜交；
（4） 將細胞匯集后進行(xing)連接(jie)，再重新分配（每(mei)孔1000~3000個細胞），用96種(zhong)條(tiao)形碼寡核苷酸通過PCR進行(xing)第四輪(lun)加編(bian)碼；
（5）最后對DNA片段進行擴增和測序。
圖1 scEpiChem的技術原理圖
研究內容
1、單(dan)細胞EpiChem分析小分子藥(yao)物的基因組結(jie)合位點
首先，研(yan)究者驗(yan)證了(le)該(gai)方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)準(zhun)確性，如圖2。通過分(fen)析K562和(he)HGC27細胞中JQ1-btn（BET溴結(jie)構域(yu)蛋白(bai)抑(yi)制劑JQ1的(de)(de)(de)生物(wu)素化衍生物(wu)小(xiao)分(fen)子(zi)）的(de)(de)(de)聚合和(he)單(dan)細胞譜，發現在代表性基(ji)因(yin)(yin)組(zu)位點周圍與BRD4（BET蛋白(bai)）表現出(chu)(chu)相似的(de)(de)(de)模式，但在兩(liang)個人類細胞系之(zhi)間顯示出(chu)(chu)不同的(de)(de)(de)JQ1-btn結(jie)合位點。人鼠物(wu)種混合實驗(yan)以(yi)驗(yan)證該(gai)方(fang)法(fa)能得(de)到單(dan)細胞的(de)(de)(de)信(xin)息，碰撞率為1.2%。來自兩(liang)種生物(wu)素化小(xiao)分(fen)子(zi)（JQ1-btn和(he)THZ1-btn）數據集的(de)(de)(de)非重復讀(du)取和(he)峰讀(du)取分(fen)數（FRiP）中也獲(huo)得(de)了(le)一致的(de)(de)(de)數據質(zhi)量。表明scEpiChem能以(yi)高信(xin)噪比對小(xiao)分(fen)子(zi)靶向的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)結(jie)合位點進(jin)行高通量分(fen)析。
圖2 小分子藥物基因組結合位點的(de)單細(xi)胞EpiChem譜分析
2、單(dan)細胞EpiChem聯合分析小分子藥物JQ1的(de)基因組結合與組蛋白修飾(shi)或染(ran)色質(zhi)可及性
研(yan)究(jiu)人(ren)員(yuan)進一(yi)步展示了(le)(le)scEpiChem的(de)(de)聯合(he)(he)分(fen)析能力。對K562：HGC27 =1：1的(de)(de)混合(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)系體系中使用JQ1-btn，驗證(zheng)了(le)(le)scEpiChem區(qu)分(fen)雙(shuang)模態(tai)細(xi)(xi)胞(bao)混合(he)(he)物(wu)的(de)(de)能力（圖(tu)3b）。根(gen)據5-kb全基因組信號(hao)計算相關性發現，JQ1-btn與(yu)H3K27me3信號(hao)之(zhi)間存(cun)在明顯(xian)分(fen)離，BRD4位點周(zhou)圍聚集單細(xi)(xi)胞(bao)JQ1-btn信號(hao)，而(er)JQ1-btn與(yu)H3K27me3信號(hao)互斥，證(zheng)實了(le)(le)JQ1-btn的(de)(de)靶標(biao)BRD4以高乙酰化組蛋白(bai)修飾且(qie)缺乏H3K27me3的(de)(de)特征與(yu)染(ran)色質(zhi)區(qu)域結合(he)(he)。之(zhi)后研(yan)究(jiu)人(ren)員(yuan)將(jiang)scATAC-seq引(yin)入scEpiChem，證(zheng)實了(le)(le)scEpiChem在同時(shi)檢(jian)測藥(yao)物(wu)-靶標(biao)結合(he)(he)與(yu)染(ran)色質(zhi)可及(ji)性的(de)(de)能力（圖(tu)3e-g），并(bing)能夠識別出(chu)藥(yao)物(wu)與(yu)靶蛋白(bai)結合(he)(he)之(zhi)間的(de)(de)細(xi)(xi)微差異。這些研(yan)究(jiu)結果(guo)表(biao)明，scEpiChem能夠成功地同時(shi)測量藥(yao)物(wu)靶點結合(he)(he)和(he)染(ran)色質(zhi)結合(he)(he)蛋白(bai)/可及(ji)性。
圖3 scEpiChem 實現小分(fen)子JQ1基因組結合(he)和組蛋白(bai)修飾或染色質可及(ji)性(xing)的聯合(he)檢(jian)測(ce)
3、單細胞EpiChem鑒定結(jie)直腸(chang)癌類器官中不同小分子藥物(wu)的細胞類型(xing)特異性基(ji)因組結(jie)合動態
為(wei)了(le)證明(ming)單(dan)細(xi)胞EpiChem在(zai)(zai)實際應用中(zhong)的價值，研究者(zhe)綜合(he)多模態分(fen)(fen)析(xi)以(yi)揭示多種藥(yao)物(wu)與腫瘤異(yi)質(zhi)性(xing)的相互作用。上皮(pi)-間(jian)質(zhi)轉化(hua)(EMT)過程在(zai)(zai)各種生物(wu)現象(xiang)中(zhong)起著關鍵作用，包括胚胎發(fa)育和癌癥轉移。通過構(gou)建H3K27ac和三(san)種生物(wu)素化(hua)小(xiao)分(fen)(fen)子(zi)（JQ1-btn、THZ1-btn和Dox-btn）在(zai)(zai)上皮(pi)-間(jian)質(zhi)轉化(hua)（EMT）過程中(zhong)的單(dan)細(xi)胞動(dong)態基因組結合(he)圖(tu)譜，確定了(le)上皮(pi)細(xi)胞和中(zhong)間(jian)EMT細(xi)胞兩個細(xi)胞群（圖(tu)4a, b）。擬(ni)時序分(fen)(fen)析(xi)揭示了(le)結直腸(chang)癌（CRC）類器(qi)官中(zhong)存在(zai)(zai)從上皮(pi)細(xi)胞到中(zhong)間(jian)EMT細(xi)胞的分(fen)(fen)化(hua)軌跡（圖(tu)4c）。此外(wai)，EMT期間(jian)JQ1-btn、THZ1-btn和Dox-btn在(zai)(zai)GPN3上的信號富(fu)集(ji)（圖(tu)4d, e）。GO富(fu)集(ji)分(fen)(fen)析(xi)表明(ming)：沿(yan)分(fen)(fen)化(hua)軌跡的H3K27ac信號動(dong)態變化(hua)伴(ban)隨不同小(xiao)分(fen)(fen)子(zi)基因組分(fen)(fen)布及獨(du)特的基因功能（圖(tu)4f）。
圖4 scEpiChem鑒定三種(zhong)小分子藥物(wu)在人(ren)CRC類器官中(zhong)細胞類型特異性基因組結合動力學(xue)
4、單細胞(bao)EpiChem動態繪(hui)制JQ1-btn基因組結合及其在結直腸癌(ai)類器官中BRD4的結合情況
之后，研究者(zhe)探究了(le)EMT期間(jian)藥(yao)物(wu)-靶(ba)(ba)點(dian)(dian)結(jie)合和(he)表觀(guan)基因(yin)組景(jing)觀(guan)的(de)(de)(de)動(dong)態關系，以進一步揭示染(ran)色質(zhi)(zhi)狀態下藥(yao)物(wu)結(jie)合位(wei)點(dian)(dian)與其蛋白質(zhi)(zhi)靶(ba)(ba)點(dian)(dian)之間(jian)的(de)(de)(de)復雜(za)關系。研究人員同時進行了(le)CRC類器官的(de)(de)(de)ATAC-seq，鑒定(ding)出兩(liang)個主要群(qun)，并進行了(le)擬時序分析(xi)（圖5a、b）。在中間(jian)EMT細胞的(de)(de)(de)VIM位(wei)點(dian)(dian)發現(xian)了(le)顯著的(de)(de)(de)JQ1-btn、BRD4和(he)ATAC信(xin)號(hao)，在上皮細胞CDH1位(wei)點(dian)(dian)也(ye)有(you)顯著信(xin)號(hao)（圖5c）。接(jie)著建(jian)立(li)了(le)與EMT相關的(de)(de)(de)假定(ding)JQ1-BRD4靶(ba)(ba)向連接(jie)（圖5d），并將(jiang)這些連接(jie)按照ATAC信(xin)號(hao)的(de)(de)(de)動(dong)態軌跡分為(wei)三個簇(cu)（圖5d）。各簇(cu)表現(xian)出JQ1-btn與BRD4協同信(xin)號(hao)的(de)(de)(de)異質(zhi)(zhi)性與獨(du)特(te)的(de)(de)(de)信(xin)號(hao)傳(chuan)導通路(lu)（圖5e, f），表明藥(yao)物(wu)基因(yin)組結(jie)合和(he)表觀(guan)基因(yin)組景(jing)觀(guan)的(de)(de)(de)調節(jie)相互作用。
圖5 scEpiChem動態定位JQ1-btn基因組結(jie)合及其靶BRD4在人類CRC類器官中的(de)作用
總(zong) 結
scEpiChem提(ti)供(gong)了一個全面的高通量分析框架，捕(bu)捉了傳統bulk分析無法揭示的小分子(zi)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)反應的細胞異質(zhi)(zhi)性特征(zheng)。它識別了不同細胞類型在(zai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)-染色質(zhi)(zhi)結合與(yu)(yu)靶蛋(dan)(dan)(dan)白-染色質(zhi)(zhi)結合上的細微差異，從而揭示了藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)與(yu)(yu)已知靶標蛋(dan)(dan)(dan)白共享和獨特結合位點的特征(zheng)。在(zai)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)耐藥(yao)(yao)(yao)(yao)性研(yan)究中，scEpiChem通過同時映射單細胞中的小分子(zi)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)和組蛋(dan)(dan)(dan)白修飾特征(zheng)，為研(yan)究藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)與(yu)(yu)動態表觀基因(yin)(yin)組景觀之間的多(duo)樣化相互(hu)作用開辟了新(xin)途徑(jing)，識別出一系列可(ke)能參與(yu)(yu)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)反應的轉錄因(yin)(yin)子(zi)。這些結果對(dui)于設計更(geng)有針對(dui)性和更(geng)有效的治療策略至(zhi)關重要，例(li)如組合選定的小分子(zi)藥(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)以(yi)克服耐藥(yao)(yao)(yao)(yao)性。
