前言

說起表觀遺傳學(xue)，大家可能一知半解，遺傳？有點熟悉，表觀？又有點陌生。那什么是(shi)表觀遺傳學(xue)呢(ni)？我們從生活中常見(jian)的幾個(ge)現象說起。

1、橘生(sheng)淮南則(ze)為橘，橘生(sheng)淮北(bei)則(ze)為枳(zhi)，葉(xie)徒(tu)相似，其實味不同(tong)。所以然者何？水土異也。同(tong)一種水果在不同(tong)的(de)產地生(sheng)長，其葉(xie)和味都有(you)了很大的(de)改變。

2、同卵雙(shuang)胞胎有著相同的(de)基因組，但他(ta)們(men)長大(da)成人(ren)后性格、外貌、喜好、言(yan)行(xing)都有很大(da)的(de)差異。

這些都是基因型相同而表型不同的現象。那在不改變DNA序列的情況下，基因表達如何受到調控以及這些變化是如何被繼承給下一代的呢？這就是表觀遺傳學研究的內容。表觀遺傳學技術覆蓋DNA、RNA、Chromatin三大方向，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA調控、染(ran)色質(zhi)可及性分析(xi)等等。

由于很多老(lao)師(shi)總是混淆表觀遺傳的(de)一些測(ce)序技術，進而影響到(dao)方案(an)設計以及成果轉(zhuan)化。因此(ci)我們對表觀組(zu)學常用到(dao)的(de)測(ce)序技術以及常見問答進行(xing)了(le)整理，希望能對您有所幫助。下面就(jiu)跟隨(sui)小派(pai)一起來看(kan)下吧！

測序技術

1、ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）是利用Tn5轉座酶探究可接近性染色質高通量測序技術。該技術通過Tn5轉座酶對特定時空下開放的核染色質區域進行切割，獲得在該時空下基因組中所有活躍轉錄的調控序列。因此，ATAC-seq得到的是全基(ji)因組尺度上處于開放狀態的染(ran)色(se)質(zhi)區域(yu)，并且通過分析染(ran)色(se)質(zhi)開放區域(yu)的motif，可以(yi)獲得潛在的活(huo)躍轉錄(lu)因子(zi)及其靶基(ji)因。

一(yi)次過(guo)癮，你想要的ATAC這里都有

2、ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）全稱染色質免疫共沉淀測序，是一種用于研究蛋白質與DNA相互作用的技術，能(neng)夠精確地識別特定蛋(dan)白質，例如轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)和組蛋(dan)白，在基因(yin)組中的結合位點(dian)。

CHIP-Seq的10問10答

3、CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一種新型DNA-蛋白互作研究技術，適用于無ChIP級別抗體的蛋白研究(jiu)。相比于傳統的ChIP-seq技術，該技術無需交聯、超聲打斷、末端抹平和接頭連接等操作，因此具有省時高效、所需的樣品量少、背景信號低和可重復性好等優點，CUT&Tag反應在細胞內進行，創新性地使用了ProteinA/G-Tn5融合蛋白來結合目的蛋白上的抗體，并特異性切割目的蛋白結合的DNA，最終通過結合NGS實(shi)現靶蛋白結(jie)合位點的精準定位。

CUT&Tag-蛋白(bai)質-DNA互作關系研究的新(xin)工具

4、RIP-seq（RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing）是一種將RNA免疫共沉淀（RIP）與高通量測序技術（NGS）相結合的技術，通過免疫沉淀目標蛋白來捕獲蛋白體內結合的RNA。主要用(yong)于解析細胞內(nei)RNA與蛋白(bai)質(zhi)（特別是(shi)RNA結合蛋白(bai)，RBP）之間(jian)的相互作用(yong)。

【派森諾(nuo)項目文章(zhang)】IF39.3 ！RIP-seq科研利器-為擴張型心肌(ji)病等相關研究“加油(you)助(zhu)威”

5、MeRIP-seq（methylated RNA immunoprecipitation with next generation sequencing） 甲基化RNA免疫沉淀結合高通量測序，是在轉錄組層面研究細胞內mRNA以及lncRNA的(de)甲(jia)(jia)基化即(ji)m6A（腺(xian)嘌呤N6為甲(jia)(jia)基化）定(ding)位的(de)技(ji)術(shu)。其基本(ben)原(yuan)理是利用m6A特異(yi)性抗體(ti)，對細(xi)胞內(nei)的(de)帶有m6A修飾的(de)RNA片段(duan)(duan)進(jin)行(xing)免疫沉淀。結合高(gao)通量測序技術對沉淀下來的(de)RNA片段(duan)(duan)進(jin)行(xing)深度測序，在整個轉錄(lu)組層(ceng)面揭示(shi)RNA甲基化這種轉錄(lu)后(hou)RNA表觀修飾的(de)整體(ti)水平和定位等信(xin)息。

RNA甲基(ji)化修飾m6A檢測熱門(men)技術(shu)—MeRIP-seq

6、WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequencing，全基因組甲基化測序）其采(cai)用重亞硫酸(suan)氫(qing)鹽處理(li)基因組(zu)DNA使(shi)未甲基化(hua)修(xiu)飾的胞嘧啶(ding)(ding)C轉化(hua)為尿嘧啶(ding)(ding)U，通過對(dui)處理后的DNA進(jin)行全基因(yin)組重測(ce)序，并與參(can)考(kao)基因(yin)組進(jin)行比對(dui)，從(cong)基因(yin)組水(shui)平實現單堿(jian)基分辨(bian)率的、高精確度(du)甲基化水(shui)平分析。

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常見問答(da)

ATAC

1、Q：什么是(shi)染(ran)色質可(ke)接(jie)近性？為什么要研究(jiu)開放染(ran)色質？

A: ?染色(se)(se)質(zhi)(zhi)可(ke)(ke)接近性(xing)（Chromatin Accessibility）?是指基因(yin)(yin)組(zu)中(zhong)特(te)(te)定區(qu)域(yu)的(de)(de)DNA在特(te)(te)定條件下變得(de)易于被(bei)(bei)轉錄(lu)因(yin)(yin)子(zi)和其他調(diao)(diao)(diao)控元件接近的(de)(de)特(te)(te)性(xing)。在真核生物細胞核內，DNA與(yu)(yu)組(zu)蛋白結合(he)形成(cheng)核小(xiao)體(ti)，核小(xiao)體(ti)再進一步折疊壓縮形成(cheng)染色(se)(se)質(zhi)(zhi)。當(dang)染色(se)(se)質(zhi)(zhi)結構(gou)打開(kai)(kai)時，DNA暴露出來，這部分區(qu)域(yu)被(bei)(bei)稱為?開(kai)(kai)放(fang)染色(se)(se)質(zhi)(zhi)區(qu)域(yu)（Open Chromation region，OCR）?，允(yun)許調(diao)(diao)(diao)控因(yin)(yin)子(zi)結合(he)DNA，從(cong)而(er)進行轉錄(lu)調(diao)(diao)(diao)控。開(kai)(kai)放(fang)染色(se)(se)質(zhi)(zhi)區(qu)域(yu)通(tong)常(chang)富含(han)活(huo)性(xing)或潛在活(huo)性(xing)的(de)(de)基因(yin)(yin)啟(qi)動子(zi)及增強子(zi)序列，這些區(qu)域(yu)更容(rong)易被(bei)(bei)轉錄(lu)因(yin)(yin)子(zi)識別并結合(he)，從(cong)而(er)影響相(xiang)關基因(yin)(yin)的(de)(de)表達水(shui)平。此外，許多(duo)遺傳性(xing)疾病的(de)(de)發(fa)生與(yu)(yu)發(fa)展(zhan)都與(yu)(yu)特(te)(te)定基因(yin)(yin)表達模(mo)式的(de)(de)變化(hua)有(you)關。通(tong)過分析開(kai)(kai)放(fang)染色(se)(se)質(zhi)(zhi)狀(zhuang)態，可(ke)(ke)以幫(bang)助科(ke)學(xue)家(jia)們理(li)解某些疾病的(de)(de)分子(zi)機制，并為開(kai)(kai)發(fa)新(xin)的(de)(de)治療方法提供線索(suo)。總之，通(tong)過對(dui)開(kai)(kai)放(fang)染色(se)(se)質(zhi)(zhi)的(de)(de)研究，不僅(jin)能夠深入探(tan)討基因(yin)(yin)表達調(diao)(diao)(diao)控的(de)(de)基本原理(li)，還可(ke)(ke)能為醫學(xue)、生物學(xue)等多(duo)個(ge)領域(yu)帶來重要進展(zhan)。

2、Q：ATAC-seq與ChIP-seq異同點？

A：ATAC-Seq，是(shi)在(zai)(zai)全基因(yin)(yin)組范圍(wei)內檢測染色質的(de)開放區域，可以(yi)得到蛋(dan)白(bai)質的(de)潛在(zai)(zai)結合位點，不(bu)依賴于抗體(ti)，一般(ban)用于不(bu)知道(dao)特(te)定的(de)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)子。ChIP-Seq是(shi)實驗(yan)前(qian)明確有一個感(gan)興趣的(de)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)子，利(li)用目(mu)標轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)子特(te)異性抗體(ti)富(fu)集蛋(dan)白(bai)質及其結合的(de)DNA片段，從(cong)而驗(yan)證蛋(dan)白(bai)質與(yu)DNA的(de)相互(hu)作用關(guan)系。

3、Q：ATAC-seq能回答什么科學問題(ti)？

A：找(zhao)(zhao)調控(kong)某一生物學過程的(de)關鍵轉錄因(yin)子；找(zhao)(zhao)哪個轉錄因(yin)子調控(kong)了我感(gan)興(xing)趣(qu)的(de)基因(yin)；找(zhao)(zhao)我感(gan)興(xing)趣(qu)的(de)轉錄因(yin)子調控(kong)的(de)靶基因(yin)。如果沒(mei)有ChIP級(ji)別的(de)抗體，無法做ChIP-seq，就可(ke)以用(yong) ATAC-seq 找(zhao)(zhao)轉錄因(yin)子的(de)靶基因(yin)。

4、Q：motif分析(xi)是什(shen)么意思？

A：轉錄因(yin)子等與DNA序列的(de)(de)結(jie)合位(wei)點具(ju)有一定(ding)的(de)(de)的(de)(de)特(te)征(zheng)，這些(xie)特(te)征(zheng)具(ju)有保(bao)守性(xing)，這些(xie)具(ju)有保(bao)守性(xing)的(de)(de)特(te)征(zheng)序列叫(jiao)做motif，motif分析就是解析目標區域(yu)具(ju)有保(bao)守性(xing)的(de)(de)DNA結(jie)合位(wei)點，結(jie)果中會(hui)有序列logo圖片，不同(tong)高度的(de)(de)字(zi)母表(biao)(biao)示(shi)每個位(wei)置(zhi)上核苷(gan)酸(suan)的(de)(de)頻(pin)率(lv)，較(jiao)高的(de)(de)字(zi)母表(biao)(biao)示(shi)該位(wei)置(zhi)上某種核苷(gan)酸(suan)出現的(de)(de)頻(pin)率(lv)較(jiao)高，較(jiao)低的(de)(de)字(zi)母表(biao)(biao)示(shi)頻(pin)率(lv)較(jiao)低。

5、Q：ATAC項目結果中酶(mei)切片段的(de)長度(du)分布峰怎么看？

A：酶(mei)切(qie)片(pian)段(duan)是(shi)指ATAC-seq實驗中經(jing)轉座酶(mei)Tn5切(qie)割后獲得的(de)(de)DNA片(pian)段(duan)。酶(mei)切(qie)片(pian)段(duan)的(de)(de)長度分(fen)(fen)布可以(yi)反映Tn5 酶(mei)用量是(shi)否合適。單個(ge)核小體是(shi)由146bp的(de)(de)DNA纏繞(rao)在組蛋白(bai)上構成(cheng)的(de)(de)，適量的(de)(de)Tn5酶(mei)只會切(qie)割裸露(lu)的(de)(de)DNA，而不會切(qie)割被(bei)核小體保護的(de)(de)DNA，因此正(zheng)常實驗，酶(mei)切(qie)片(pian)段(duan)長度分(fen)(fen)布圖中會出(chu)現(xian)2-3個(ge)峰(feng)，分(fen)(fen)別為短片(pian)段(duan)峰(feng)：小于(yu)(yu)150 bp，對(dui)應(ying)于(yu)(yu)非(fei)常開放的(de)(de)染(ran)色質區域(yu)；主(zhu)峰(feng)：大約在150-200 bp，對(dui)應(ying)于(yu)(yu)單核小體；次峰(feng)：大約在300-400bp，對(dui)應(ying)于(yu)(yu)雙核小體。

ChIP-seq&CUT&Tag

1、Q：chip-seq、cut&tag分析中中peak是什么意思？

A：ChIP-seq（cut&tag）分析中peak指的(de)是特定蛋白(bai)質(zhi)（如轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)或組蛋白(bai)修飾）在(zai)基因(yin)組上富集(ji)的(de)區(qu)域，這(zhe)些蛋白(bai)質(zhi)富集(ji)的(de)區(qu)域被稱(cheng)為(wei)peak，這(zhe)些peak可(ke)能位(wei)于基因(yin)的(de)啟動(dong)子(zi)區(qu)域或者基因(yin)區(qu)域。

2、Q：chip-seq、cut&tag等分(fen)析(xi)中(zhong)IP組(zu)和Input組(zu)分(fen)別代表什么，后續是如(ru)何分(fen)析(xi)的？

A：IP組是指通(tong)過特定抗體(ti)捕獲目(mu)標蛋白及其結合(he)的(de)DNA片段后(hou)得到的(de)樣(yang)本，Input組是指在進(jin)行免疫沉淀之前，從細(xi)胞(bao)或組織中提取的(de)總DNA樣(yang)本，分析時input組通(tong)常作為背景對照，用于校正(zheng)和歸(gui)一化IP組的(de)數據。

3、Q：在Peaks_Annotation的文件夾中(zhong)Locus和Nearest分別代表什么？

A：Peak_annotation的(de)(de)結果(guo)是(shi)(shi)(shi)對peak落點基因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)分析，peak在(zai)(zai)(zai)基因(yin)(yin)(yin)上(shang)的(de)(de)落點主要分為兩種，一種是(shi)(shi)(shi)在(zai)(zai)(zai)基因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)上(shang)下(xia)游(you)區(qu)域，另(ling)一種是(shi)(shi)(shi)落在(zai)(zai)(zai)基因(yin)(yin)(yin)區(qu)域，Locus文(wen)件(jian)夾中是(shi)(shi)(shi)對peak落點在(zai)(zai)(zai)基因(yin)(yin)(yin)區(qu)域的(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)注釋表格，Nearest文(wen)件(jian)夾是(shi)(shi)(shi)peak落點在(zai)(zai)(zai)基因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)啟動子區(qu)域的(de)(de)基因(yin)(yin)(yin)注釋表格。

4、Q:如何查看結果中(zhong)某個(ge)peak對應基因(yin)的reads覆蓋峰(feng)圖？

A：可以使(shi)用(yong)IGV軟(ruan)件打開Map文(wen)(wen)件中各樣本的bam文(wen)(wen)件，通(tong)過bam文(wen)(wen)件查(cha)看(kan)某個(ge)基因(yin)具體(ti)位置reads的覆蓋(gai)情況，IGV軟(ruan)件使(shi)用(yong)教程：干貨！IGV快速入門(men)手(shou)冊

5、Q:chip-seq分析中基因附近信號分布圖(tu)怎么看？

A：信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)分布圖(tu)包含信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)譜(pu)圖(tu)和熱圖(tu)兩(liang)部分，信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)譜(pu)圖(tu)橫坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)是基因(yin)的(de)(de)位(wei)(wei)(wei)置信(xin)(xin)(xin)息，TSS代(dai)(dai)(dai)表基因(yin)的(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄起始位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)，TES代(dai)(dai)(dai)表轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄的(de)(de)終止位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)，-3.0代(dai)(dai)(dai)表轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄起始位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)上(shang)(shang)游(you)(you)(you)(you) 3kb ，3.0kb代(dai)(dai)(dai)表轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄終止位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)下游(you)(you)(you)(you)3kb，縱坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)代(dai)(dai)(dai)表的(de)(de)是在基因(yin)的(de)(de)不同位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)peak的(de)(de)平均信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)值，整個信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)譜(pu)圖(tu)代(dai)(dai)(dai)表的(de)(de)是peak在轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄起始位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)TSS上(shang)(shang)游(you)(you)(you)(you) 3kb 到轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄終止位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)下游(you)(you)(you)(you)3kb 范圍內每個位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)上(shang)(shang)所有基因(yin)的(de)(de)平均信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)值；下方是對應(ying)的(de)(de)信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)熱圖(tu)，每一(yi)行代(dai)(dai)(dai)表每一(yi)個基因(yin)，橫坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)代(dai)(dai)(dai)表的(de)(de)同樣是轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄起始位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)TSS上(shang)(shang)游(you)(you)(you)(you) 3kb 到轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄終止位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)下游(you)(you)(you)(you)3kb 范圍內每個位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)上(shang)(shang)對應(ying)的(de)(de)信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)值，顏色越偏黃，則表明(ming)附(fu)近有較強的(de)(de)信(xin)(xin)(xin)號(hao)(hao)峰出現，該區域的(de)(de)reads覆蓋(gai)越多。

RIP-seq

1、Q：RIP 試驗(yan)需要注意些什么？

A：1.防止(zhi) RNA與(yu)蛋(dan)白(bai)非特異性結(jie)合(he)(he)；2.避免RNA 蛋(dan)白(bai)質結(jie)合(he)(he)被破壞；3.避免外(wai)源(yuan)RNase污染；4.抑(yi)制內源(yuan)RNase的(de)(de)(de)活性；5.避免RNA結(jie)合(he)(he)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)降解；6.選擇(ze)適合(he)(he)做RIP的(de)(de)(de)抗體，一定要(yao)是IP級別的(de)(de)(de)抗體；7.細胞(bao)的(de)(de)(de)選擇(ze)，對(dui)于需要(yao)做轉染實(shi)驗的(de)(de)(de)需要(yao)選擇(ze)轉染效率較高(gao)的(de)(de)(de)、RNA 在細胞(bao)中(zhong)本(ben)底表(biao)達量要(yao)相對(dui)較高(gao)的(de)(de)(de)。

2、Q：一般RIPSeq項目(mu)(mu)高質量uniq序(xu)列占比是多少(shao)為(wei)正常？CallPeak數目(mu)(mu)是否和高質量uniq序(xu)列相關。callpeak所用參數是多少(shao)呢？

A：常規項目20M以上的高(gao)質量uniq序列(lie)是一(yi)個比較理想的結果。高(gao)質量uniq序列(lie)的多少是會影響callpeak的結果的，我們默認的callpeak參數是qvalue < 0.05。

3、Q：RIP和ChIP基因信號分布圖的區別是(shi)什么？

A：RIP-seq研(yan)究RNA結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)（RBPs）與(yu)(yu)RNA的(de)相互(hu)作用(yong)。ChIP-seq研(yan)究DNA結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)（如轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)、組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)修(xiu)飾等(deng)）與(yu)(yu)DNA的(de)相互(hu)作用(yong)。RIP-seq 的(de)信(xin)號(hao)分布(bu)圖主(zhu)要(yao)(yao)關(guan)注RNA的(de)不同區(qu)(qu)域(yu)(yu)（5' UTR、CDS、3' UTR、內含子(zi)(zi)(zi)），揭(jie)示RNA結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)如何(he)調(diao)(diao)控(kong)RNA的(de)代謝過程(cheng)。其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)5' UTR信(xin)號(hao)富(fu)(fu)集(ji)(ji)可(ke)能(neng)表(biao)明(ming)(ming)RNA結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)參(can)(can)(can)(can)與(yu)(yu)翻譯(yi)起始(shi)(shi)調(diao)(diao)控(kong)；編碼(ma)區(qu)(qu) (CDS)信(xin)號(hao)富(fu)(fu)集(ji)(ji)可(ke)能(neng)表(biao)明(ming)(ming)RNA結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)參(can)(can)(can)(can)與(yu)(yu)mRNA的(de)剪接(jie)、轉(zhuan)(zhuan)運、穩定性和(he)翻譯(yi)調(diao)(diao)控(kong)；3' UTR信(xin)號(hao)富(fu)(fu)集(ji)(ji)可(ke)能(neng)表(biao)明(ming)(ming)RNA結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)參(can)(can)(can)(can)與(yu)(yu)mRNA的(de)穩定性、降解(jie)和(he)翻譯(yi)抑制(zhi)；內含子(zi)(zi)(zi)信(xin)號(hao)富(fu)(fu)集(ji)(ji)可(ke)能(neng)表(biao)明(ming)(ming)RNA結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)參(can)(can)(can)(can)與(yu)(yu)剪接(jie)調(diao)(diao)控(kong)。ChIP-seq 的(de)信(xin)號(hao)分布(bu)圖主(zhu)要(yao)(yao)關(guan)注DNA的(de)不同區(qu)(qu)域(yu)(yu)（啟動(dong)子(zi)(zi)(zi)、增強(qiang)子(zi)(zi)(zi)、基(ji)因(yin)(yin)體、終(zhong)止子(zi)(zi)(zi)），揭(jie)示DNA結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)如何(he)調(diao)(diao)控(kong)基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達(da)。其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)啟動(dong)子(zi)(zi)(zi)區(qu)(qu)域(yu)(yu)信(xin)號(hao)富(fu)(fu)集(ji)(ji)可(ke)能(neng)表(biao)明(ming)(ming)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)參(can)(can)(can)(can)與(yu)(yu)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)起始(shi)(shi)調(diao)(diao)控(kong)；增強(qiang)子(zi)(zi)(zi)區(qu)(qu)域(yu)(yu)信(xin)號(hao)富(fu)(fu)集(ji)(ji)可(ke)能(neng)表(biao)明(ming)(ming)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)參(can)(can)(can)(can)與(yu)(yu)遠端調(diao)(diao)控(kong)；基(ji)因(yin)(yin)體信(xin)號(hao)富(fu)(fu)集(ji)(ji)可(ke)能(neng)表(biao)明(ming)(ming)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)修(xiu)飾或其(qi)(qi)他調(diao)(diao)控(kong)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)參(can)(can)(can)(can)與(yu)(yu)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)延伸或其(qi)(qi)他調(diao)(diao)控(kong)過程(cheng)；終(zhong)止子(zi)(zi)(zi)區(qu)(qu)域(yu)(yu)信(xin)號(hao)富(fu)(fu)集(ji)(ji)可(ke)能(neng)表(biao)明(ming)(ming)某(mou)些蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)參(can)(can)(can)(can)與(yu)(yu)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)終(zhong)止。

MeRIP-seq

1、Q：RNA甲基化(hua)分(fen)析時，peak對(dui)應的reads數是(shi)否也(ye)(ye)跟這(zhe)個RNA的表達(da)水平有關，如果這(zhe)個基因(yin)mRNA表達(da)量本來就少，那是(shi)否甲基化(hua)peak也(ye)(ye)少呢？

A:這(zhe)兩者有一定(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)關聯，但不是絕對的(de)(de)(de)(de)，一個基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)mRNA表達(da)水(shui)平(ping)高(gao)并(bing)不直接意(yi)味(wei)著其甲(jia)(jia)基化(hua)修(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)程(cheng)度(du)高(gao)，有些(xie)低表達(da)的(de)(de)(de)(de)基因(yin)(yin)，可(ke)(ke)能由于其低表達(da)所導致(zhi)檢測到(dao)的(de)(de)(de)(de)甲(jia)(jia)基化(hua)的(de)(de)(de)(de)peak會少一些(xie)，RNA甲(jia)(jia)基化(hua)更多地是一種(zhong)調控機制，參與調控特定(ding)(ding)RNA，如穩定(ding)(ding)性、定(ding)(ding)位和翻譯(yi)效率，而不單純(chun)由mRNA的(de)(de)(de)(de)豐度(du)決定(ding)(ding)，在某些(xie)情況下，低表達(da)的(de)(de)(de)(de)基因(yin)(yin)可(ke)(ke)能由于其RNA被甲(jia)(jia)基化(hua)并(bing)降解而導致(zhi)mRNA水(shui)平(ping)低，但這(zhe)并(bing)不是因(yin)(yin)為(wei)原始的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄水(shui)平(ping)低導致(zhi)甲(jia)(jia)基化(hua)水(shui)平(ping)低。

2、Q：為什么(me)MeRIP-seq需(xu)要同(tong)時測Input和IP樣本(ben)？

A：MeRIP-seq實驗(yan)設(she)置中(zhong)Input和IP組成(cheng)一對(dui)樣(yang)(yang)品。實驗(yan)環節IP樣(yang)(yang)品用(yong)m6A抗體(ti)特異性(xing)富(fu)集甲基化修飾的(de)RNA片(pian)段(duan)，而Input僅僅是(shi)片(pian)段(duan)化的(de)RNA則作為(wei)對(dui)照消減背(bei)景噪(zao)音，在建庫、測序平(ping)行開(kai)展。結(jie)(jie)合(he)峰檢測分析需整合(he)兩個樣(yang)(yang)本(ben)的(de)數(shu)(shu)據(ju)，并利用(yong)Input數(shu)(shu)據(ju)排除本(ben)底表(biao)達水平(ping)高(gao)或非特異性(xing)結(jie)(jie)合(he)的(de)peaks，以(yi)提高(gao)call peak的(de)準確性(xing)。

WGBS

1、Q：什么是5mC DNA甲基化(hua)？

A：DNA甲(jia)基(ji)化主要發生在(zai)胞嘧(mi)(mi)啶(ding)(ding)和鳥(niao)嘌呤(CpG)二核苷酸(suan)位點，即5'-CG-3'序列上。在(zai)DNA甲(jia)基(ji)轉移酶(mei)(DNA methyltransferases，DNMTs)的催化作(zuo)用下，將甲(jia)基(ji)供(gong)體S-腺苷-L甲(jia)硫氨酸(suan)(SAM)上的一(yi)個(ge)甲(jia)基(ji)轉移至胞嘧(mi)(mi)啶(ding)(ding)的5位碳原子(zi)處(C5)，從(cong)而形成5-甲(jia)基(ji)胞嘧(mi)(mi)啶(ding)(ding)(5mC)。

2、Q：甲基化水平是(shi)如何計算的？

A：計算方法(fa)為(wei)(wei)：支持某位(wei)(wei)點(dian)（區(qu)域(yu)）甲(jia)(jia)基化C的reads條數除以覆(fu)蓋該(gai)位(wei)(wei)點(dian)（區(qu)域(yu)）的總的reads條數，即為(wei)(wei)某位(wei)(wei)點(dian)（區(qu)域(yu)）甲(jia)(jia)基化水平，計算公式為(wei)(wei) ML=mC/(mC+umC)。例(li)如：位(wei)(wei)點(dian)A覆(fu)蓋的reads數為(wei)(wei)10，支持mC（mC）的reads數為(wei)(wei)2，不支持mC（umC）的reads數為(wei)(wei)8，該(gai)位(wei)(wei)點(dian)的甲(jia)(jia)基化水平為(wei)(wei)2/(2+8)=0.2。

3、Q：Bisulfite處理(li)后(hou)C-T轉化(hua)率正常范圍是多少？

A：用(yong)文庫中測到(dao)的Lambda噬(shi)菌體DNA序列中CHH位點的檢測結果(guo)，在分(fen)析前中對甲基(ji)(ji)化位點水平(ping)的可靠性進行評估，一般Bisulfite轉換效率在99%以(yi)上，我們則認為計(ji)算得到(dao)的C位點的甲基(ji)(ji)化水平(ping)是可靠的。

4、Q：DNA甲(jia)(jia)基化分(fen)析中差異(yi)甲(jia)(jia)基化結果diff.Methy和(he)areaStat分(fen)別代表什么，怎么通過這兩個值確認(ren)差異(yi)甲(jia)(jia)基化程度？

A：在(zai)Result\04_DMRs\DMR_result這(zhe)個文件夾中包含每個比較(jiao)組(zu)所(suo)有差(cha)異(yi)甲(jia)基化(hua)(hua)(hua)區(qu)域的(de)結果，diff.Methy這(zhe)一列代表兩(liang)組(zu)之(zhi)間的(de)差(cha)異(yi)甲(jia)基化(hua)(hua)(hua)水平，這(zhe)個值的(de)絕對值越(yue)大，代表兩(liang)組(zu)之(zhi)間差(cha)異(yi)甲(jia)基化(hua)(hua)(hua)程度越(yue)高，areaStat代表差(cha)異(yi)甲(jia)基化(hua)(hua)(hua)顯(xian)著性高低，這(zhe)個值的(de)絕對值越(yue)大，證明(ming)該差(cha)異(yi)甲(jia)基化(hua)(hua)(hua)顯(xian)著性越(yue)高。