生(sheng)(sheng)物膜(mo)(mo)(mo)的(de)形成(cheng)是細(xi)菌病原體的(de)一種關鍵生(sheng)(sheng)存策略(lve)，它(ta)不僅賦予細(xi)菌抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素(su)耐受性(xing)，還(huan)增強(qiang)(qiang)了(le)其(qi)抵(di)御(yu)宿主(zhu)免(mian)疫(yi)防御(yu)的(de)能(neng)力。此外，生(sheng)(sheng)物膜(mo)(mo)(mo)的(de)形成(cheng)是許多病原菌維持生(sheng)(sheng)存和引發持久感(gan)染的(de)重要(yao)機(ji)制。作為一種多細(xi)胞(bao)結(jie)構(gou)，生(sheng)(sheng)物膜(mo)(mo)(mo)展現(xian)了(le)顯著的(de)代謝和轉錄(lu)異質(zhi)性(xing)，并對抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素(su)以(yi)及宿主(zhu)免(mian)疫(yi)系統具(ju)有較強(qiang)(qiang)的(de)抗(kang)(kang)性(xing)。傳(chuan)統的(de)轉錄(lu)組(zu)分(fen)析通常聚焦于(yu)(yu)整體細(xi)胞(bao)，難(nan)以(yi)揭示生(sheng)(sheng)物膜(mo)(mo)(mo)內(nei)亞群的(de)復雜異質(zhi)性(xing)。近年來(lai)，單細(xi)胞(bao)RNA測序（scRNA-seq）技(ji)術被廣泛應用(yong)于(yu)(yu)異質(zhi)性(xing)樣(yang)本的(de)轉錄(lu)組(zu)研究，但由(you)于(yu)(yu)細(xi)菌RNA具(ju)有短半衰期(qi)、低(di)豐度及細(xi)胞(bao)壁的(de)特殊性(xing)，相關研究主(zhu)要(yao)集中在浮(fu)游細(xi)胞(bao)狀態，難(nan)以(yi)深入分(fen)析生(sheng)(sheng)物膜(mo)(mo)(mo)中的(de)細(xi)菌群體。

2024年11月，美(mei)國內布拉斯加大學(xue)醫學(xue)中心病理學(xue)、微生物學(xue)與免(mian)疫(yi)學(xue)系的(de)Lee E. Korshoj和Tammy Kielian在Nature Communications雜志在線發表題為“Bacterial single-cell RNA sequencing captures biofilm transcriptional heterogeneity and differential responses to immune pressure”研(yan)究(jiu)論(lun)文。本研(yan)究(jiu)提出了一種(zhong)優(you)化(hua)的(de)細菌單細胞(bao)RNA測序(xu)（scRNA-seq）技術——BaSSSh-seq，用于解析金黃色葡萄球(qiu)菌生物膜群(qun)體(ti)中的(de)轉(zhuan)錄異(yi)質性。與傳統(tong)的(de)整體(ti)RNA測序(xu)相(xiang)比，BaSSSh-seq能(neng)夠在單細胞(bao)水平上捕獲生物膜中多樣(yang)且動態的(de)轉(zhuan)錄狀態，即使(shi)是代謝活動低(di)的(de)細胞(bao)群(qun)體(ti)也(ye)能(neng)被有效研(yan)究(jiu)。

1、技術(shu)原理

BaSSSh-seq（bacterial scRNA-seq with split-pool barcoding, second strand synthesis, and subtractive hybridization）是一(yi)種優化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)技(ji)術協議，用(yong)(yong)(yong)于從代謝活性較低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)細(xi)胞(bao)(bao)中捕獲RNA，特(te)別(bie)適用(yong)(yong)(yong)于生(sheng)物(wu)膜中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)。該方(fang)法采(cai)用(yong)(yong)(yong)基于板(ban)式分(fen)池條(tiao)形(xing)碼(ma)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)策(ce)略對單細(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行(xing)(xing)標記(ji)，無(wu)需依賴復雜的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)商(shang)業設(she)備。在分(fen)池條(tiao)形(xing)碼(ma)過(guo)(guo)(guo)程中，三(san)個條(tiao)形(xing)碼(ma)組合(he)連接到固定和(he)(he)透化(hua)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)胞(bao)(bao)內RNA轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)本上(shang)，其(qi)中末端條(tiao)形(xing)碼(ma)寡核苷酸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)5′端包(bao)括(kuo)UMI（唯一(yi)標識符）、PCR引物(wu)和(he)(he)生(sheng)物(wu)素(su)標簽。細(xi)胞(bao)(bao)裂解后，鏈(lian)(lian)霉親(qin)和(he)(he)素(su)磁珠(zhu)被用(yong)(yong)(yong)來(lai)純化(hua)捕獲的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)物(wu)。為(wei)確保RNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)無(wu)偏捕獲，分(fen)池條(tiao)形(xing)碼(ma)標記(ji)過(guo)(guo)(guo)程中使用(yong)(yong)(yong)了隨機(ji)(ji)六聚(ju)體。此外，通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)第(di)(di)二鏈(lian)(lian)合(he)成(cheng)(cheng)代替效率(lv)較低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)模板(ban)轉(zhuan)(zhuan)換過(guo)(guo)(guo)程，從而生(sheng)成(cheng)(cheng)高質量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cDNA文庫(ku)。采(cai)用(yong)(yong)(yong)無(wu)酶雙(shuang)鏈(lian)(lian)消(xiao)減雜交(jiao)（subtractive hybridization）技(ji)術，有效去除(chu)(chu)了大量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)rRNA，尤其(qi)是5S、16S和(he)(he)23S rRNA。具(ju)體而言，針對這些rRNA片段(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)素(su)標記(ji)寡核苷酸與(yu)cDNA鏈(lian)(lian)退火，并(bing)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)鏈(lian)(lian)霉親(qin)和(he)(he)素(su)磁珠(zhu)進(jin)行(xing)(xing)磁性去除(chu)(chu)，rRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)去除(chu)(chu)效率(lv)可將其(qi)含量(liang)從超過(guo)(guo)(guo)90%降至(zhi)低于50%。考慮(lv)到細(xi)菌(jun)(jun)(jun)mRNA本身的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)豐度較低，這一(yi)方(fang)法對于細(xi)菌(jun)(jun)(jun)單細(xi)胞(bao)(bao)RNA測序(xu)至(zhi)關重要。接下來(lai)，采(cai)用(yong)(yong)(yong)隨機(ji)(ji)引物(wu)進(jin)行(xing)(xing)第(di)(di)二鏈(lian)(lian)合(he)成(cheng)(cheng)，并(bing)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)PCR擴增生(sheng)成(cheng)(cheng)雙(shuang)鏈(lian)(lian)cDNA。最終，通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)片段(duan)化(hua)、連接和(he)(he)擴增，構建用(yong)(yong)(yong)于Illumina測序(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)文庫(ku)，該文庫(ku)包(bao)含具(ju)有P5/P7末端和(he)(he)獨(du)特(te)i5/i7索引的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)構建體。

圖(tu)1 BaSSSh-seq 結合rRNA去除(chu)技術實現了(le)細菌生(sheng)物膜(mo)的單細胞(bao)RNA測序(xu)

2、主(zhu)要(yao)結果

1.生(sheng)物膜生(sheng)長表(biao)現出廣泛的(de)轉錄異質(zhi)性和(he)代謝(xie)基因(yin)表(biao)達的(de)下(xia)降

通過對生(sheng)物(wu)膜(mo)和浮(fu)游生(sheng)長(chang)狀(zhuang)態的細(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄(lu)組數據進行聚(ju)類分析，揭示了生(sheng)物(wu)膜(mo)中(zhong)比浮(fu)游生(sheng)長(chang)狀(zhuang)態更(geng)顯(xian)著的轉(zhuan)錄(lu)多(duo)樣性。在生(sheng)物(wu)膜(mo)中(zhong)，識別出了七個轉(zhuan)錄(lu)特征明顯(xian)不(bu)同的細(xi)胞(bao)亞(ya)(ya)群(qun)(qun)。大(da)多(duo)數這些亞(ya)(ya)群(qun)(qun)表(biao)現出與(yu)代謝(xie)相(xiang)關(guan)的基因表(biao)達(da)顯(xian)著降低(di)，而與(yu)遺傳變異、營養限制和應激反應相(xiang)關(guan)的基因則在特定(ding)亞(ya)(ya)群(qun)(qun)中(zhong)顯(xian)著上調。此外(wai)，代謝(xie)途徑(jing)的比較分析表(biao)明，生(sheng)物(wu)膜(mo)細(xi)胞(bao)傾向于依賴發酵代謝(xie)，而浮(fu)游細(xi)胞(bao)則顯(xian)示出更(geng)高的有氧代謝(xie)活性。

圖2 生(sheng)物膜生(sheng)長的(de)特點是廣泛的(de)轉(zhuan)錄異質性以及單細胞水平上代謝(xie)基因表達(da)的(de)下降

2.從浮游生長到生物膜生長的轉錄調(diao)控軌跡

通過整合獨立成分(fen)(fen)分(fen)(fen)析(xi)(xi)（ICA）和(he)(he)偽(wei)(wei)時(shi)(shi)間(jian)軌跡分(fen)(fen)析(xi)(xi)，本研(yan)究(jiu)構建了從浮游(you)生(sheng)長到生(sheng)物(wu)(wu)膜(mo)形成的轉(zhuan)錄(lu)(lu)調(diao)控網絡及其動態(tai)路徑。結果表明(ming)，浮游(you)細(xi)胞的轉(zhuan)錄(lu)(lu)活性最高，而(er)某些生(sheng)物(wu)(wu)膜(mo)亞群(qun)則(ze)表現出顯著(zhu)的轉(zhuan)錄(lu)(lu)靜止狀態(tai)。軌跡分(fen)(fen)析(xi)(xi)進(jin)一步揭示了與(yu)(yu)偽(wei)(wei)時(shi)(shi)間(jian)相關(guan)的基因表達(da)動態(tai)，其中與(yu)(yu)生(sheng)物(wu)(wu)膜(mo)毒力(li)和(he)(he)適應性相關(guan)的基因呈逐步上調(diao)趨勢(shi)，而(er)涉及復制、轉(zhuan)錄(lu)(lu)和(he)(he)糖酵(jiao)解(jie)的基因則(ze)逐漸下調(diao)。

圖3 轉(zhuan)錄調控沿著從浮游生(sheng)長到生(sheng)物(wu)膜生(sheng)長的軌(gui)跡進行

3.生物膜表現出(chu)協調的轉錄調控(kong)網絡

生(sheng)物(wu)膜內不同亞(ya)群(qun)(qun)的(de)(de)轉錄調控展現(xian)出顯著的(de)(de)異(yi)質(zhi)性。例(li)如(ru)，碳代謝(xie)、毒力和應(ying)激反(fan)應(ying)等網絡(luo)在(zai)特(te)定(ding)亞(ya)群(qun)(qun)中(zhong)表現(xian)出顯著活躍的(de)(de)表達模式，而(er)其(qi)他亞(ya)群(qun)(qun)則顯示出代謝(xie)靜止或偏(pian)向(xiang)特(te)定(ding)環境適應(ying)的(de)(de)特(te)征。此外，某些生(sheng)物(wu)膜亞(ya)群(qun)(qun)的(de)(de)特(te)有標志基因（如(ru)與毒力和營養吸收相關的(de)(de)基因）進一步揭(jie)示了(le)它(ta)們在(zai)維(wei)持生(sheng)物(wu)膜功(gong)能中(zhong)的(de)(de)特(te)殊(shu)作用。

圖(tu)4 生物膜表現出(chu)協調的(de)轉錄(lu)調控(kong)

4.生(sheng)物(wu)膜(mo)亞群具(ju)有(you)多樣化的基(ji)因表達特征(zheng)

本研究揭示(shi)了金黃色(se)葡(pu)萄球菌(jun)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)膜內不同亞(ya)(ya)群(qun)之(zhi)間顯(xian)著(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)異(yi)質(zhi)性(xing)。通過(guo)UMAP聚類分析(xi)，識別出多個獨(du)特(te)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)膜亞(ya)(ya)群(qun)，并為每個亞(ya)(ya)群(qun)標注了特(te)征基(ji)(ji)因(yin)。例(li)如(ru)，某些(xie)亞(ya)(ya)群(qun)的(de)(de)(de)(de)標志性(xing)基(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)它們具有較高的(de)(de)(de)(de)代(dai)謝活性(xing)、特(te)定的(de)(de)(de)(de)毒力調控(kong)機制(zhi)或適應環境(jing)壓力的(de)(de)(de)(de)能(neng)力。這(zhe)些(xie)亞(ya)(ya)群(qun)的(de)(de)(de)(de)功能(neng)差異(yi)反(fan)映(ying)了生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)膜內部復雜的(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)調控(kong)網(wang)絡(luo)。研究進一步發(fa)(fa)現(xian)，部分亞(ya)(ya)群(qun)表(biao)(biao)(biao)現(xian)出對(dui)鐵(tie)(tie)和(he)營(ying)養物(wu)(wu)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)依(yi)賴性(xing)增強（如(ru)鐵(tie)(tie)調節(jie)表(biao)(biao)(biao)面決定蛋白和(he)氨基(ji)(ji)酸相關基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)上調），而其他亞(ya)(ya)群(qun)則展現(xian)了在應對(dui)銅脅迫和(he)pH調節(jie)方(fang)面的(de)(de)(de)(de)獨(du)特(te)特(te)征。此外，與遺(yi)傳變異(yi)、DNA修復和(he)重組相關的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)在某些(xie)亞(ya)(ya)群(qun)中(zhong)顯(xian)著(zhu)(zhu)表(biao)(biao)(biao)達(da)，表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)這(zhe)些(xie)細胞在動態環境(jing)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)適應能(neng)力。這(zhe)些(xie)結果(guo)表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)，生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)膜中(zhong)的(de)(de)(de)(de)細胞并非均(jun)質(zhi)群(qun)體，而是由(you)功能(neng)和(he)基(ji)(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)達(da)差異(yi)顯(xian)著(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)亞(ya)(ya)群(qun)組成，這(zhe)些(xie)亞(ya)(ya)群(qun)在生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)膜的(de)(de)(de)(de)形成、維持及環境(jing)適應中(zhong)發(fa)(fa)揮著(zhu)(zhu)關鍵作用。

圖(tu)5 生物膜亞群具有多樣(yang)化的基因表達特征

5.生(sheng)物膜在(zai)免疫(yi)細胞壓力下的轉錄(lu)適應

通(tong)過與巨(ju)噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)（MΦ）、中性粒(li)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)（PMNs）和(he)髓源性抑制(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)（G-MDSCs）的(de)(de)共培養(yang)，研究(jiu)揭示了(le)生物膜在不同免(mian)疫(yi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)壓力(li)下的(de)(de)特異性轉(zhuan)錄適(shi)應機制(zhi)。UMAP聚(ju)類分析(xi)表明，不同免(mian)疫(yi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)誘(you)導的(de)(de)生物膜轉(zhuan)錄群(qun)體具有顯著差異，反(fan)映了(le)其對(dui)免(mian)疫(yi)挑戰的(de)(de)差異性反(fan)應。此(ci)外(wai)，毒(du)力(li)、應激反(fan)應及代謝相關的(de)(de)轉(zhuan)錄調控網絡在不同免(mian)疫(yi)環(huan)境下的(de)(de)變化為研究(jiu)生物膜-宿(su)主相互作用提(ti)供了(le)新(xin)視角。

圖6 生物(wu)膜對不同(tong)的(de)免疫壓力表現出(chu)差異化的(de)響應

3、總結

這(zhe)項研(yan)究(jiu)開發了一(yi)種優(you)化的(de)(de)(de)細(xi)(xi)菌(jun)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)RNA測(ce)序技術(shu)——BaSSSh-seq，成功揭示(shi)了金(jin)黃色葡萄球菌(jun)生(sheng)物膜內部顯(xian)著(zhu)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)異質性。BaSSSh-seq的(de)(de)(de)應用不(bu)僅(jin)為(wei)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)水平上(shang)研(yan)究(jiu)細(xi)(xi)菌(jun)群(qun)體提(ti)供(gong)(gong)了強(qiang)有力的(de)(de)(de)工具，還為(wei)深(shen)入理解生(sheng)物膜的(de)(de)(de)病理生(sheng)物學(xue)及開發抗生(sheng)物膜治(zhi)療策略奠定(ding)了基(ji)礎。作為(wei)抗生(sheng)素耐藥(yao)性和(he)慢性感(gan)染的(de)(de)(de)重要推動因素，生(sheng)物膜的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)突破為(wei)未來(lai)生(sheng)物膜相關感(gan)染的(de)(de)(de)診斷(duan)和(he)治(zhi)療提(ti)供(gong)(gong)了新的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)方向。