2017-03-31
派森諾(nuo)生物(wu)與華東(dong)理工大學合作(zuo)，應(ying)用宏基(ji)因組學的(de)方法，挖掘棉(mian)花(hua)降解中新(xin)的(de)糖(tang)苷水解酶代謝路徑，其研(yan)究(jiu)成果于2016年(nian)發表(biao)于《Journal of Biotechnology》上（最新(xin)影響因子：2.667）。
1 研究背景
糖(tang)(tang)苷水(shui)解酶(mei)是水(shui)解酶(mei)家族中的(de)(de)一大(da)類(lei)，隸(li)屬于糖(tang)(tang)基(ji)(ji)酶(mei)，是所有可水(shui)解糖(tang)(tang)苷鍵的(de)(de)酶(mei)類(lei)總稱。近(jin)年(nian)來，隨著糖(tang)(tang)類(lei)物(wu)質在(zai)生物(wu)學(xue)領域(yu)內的(de)(de)重(zhong)要(yao)(yao)性越(yue)發凸顯(xian)，關于糖(tang)(tang)苷酶(mei)的(de)(de)研究與應用也(ye)變得越(yue)發重(zhong)要(yao)(yao)。在(zai)工業生產過程中，需要(yao)(yao)更高性能(neng)的(de)(de)糖(tang)(tang)苷水(shui)解酶(mei)，以便使生物(wu)質原料有效的(de)(de)降解為可發酵糖(tang)(tang)類(lei)。本文通過宏基(ji)(ji)因組學(xue)方法(fa)結合基(ji)(ji)因克隆、蛋白表(biao)達等手段(duan)，挖掘土壤微(wei)生物(wu)群落中，可以提(ti)高生物(wu)質轉化和生物(wu)制品生產的(de)(de)新的(de)(de)生物(wu)質降解酶(mei)。
2 研究方法
樣(yang)本來(lai)源(yuan)：棉(mian)花種(zhong)植(zhi)地土壤樣(yang)本
測(ce)序平臺：Illumina MiSeq+HiSeq
首(shou)先通過MiSeq平(ping)(ping)臺分別測(ce)序(xu)細菌(jun)16S V4區(qu)以及(ji)真菌(jun)ITS1區(qu)，獲取樣本中(zhong)相應(ying)的(de)菌(jun)群組成多(duo)樣性及(ji)豐度等(deng)信息；然(ran)后利(li)用HiSeq平(ping)(ping)臺對樣本進行(xing)宏基因(yin)組鳥槍(qiang)法(fa)測(ce)序(xu)，并根據(ju)測(ce)序(xu)結果(guo)在CAZy數據(ju)庫中(zhong)比對獲得相應(ying)糖(tang)苷水(shui)(shui)解酶信息；最(zui)后通過基因(yin)克(ke)隆，蛋白表達以及(ji)酶活性測(ce)定(ding)等(deng)方式挖掘新的(de)糖(tang)苷水(shui)(shui)解酶。
3 研(yan)究結果
3.1 土壤微生物群落(luo)組成分析
MiSeq平臺共產出57,883 條序列，根據97%相似度閾值歸并劃分出214個OTU，并發現在門水平優勢菌群為Proteobacteria（72%）、Bacteroidetes（17%）、Firmicutes（10%），其中Proteobacteria中以Gamma-Proteobacteria（41%）與Beta-Proteobacteria（26.1%）為主；Bacteroidetes中以Cytophagales（14.3%）為主；Firmicutes中以Bacillus（9.99%）為主。
利(li)用MetaPhlAn構建菌群結構分(fen)類(lei)等級樹，以不同顏色(se)區分(fen)各分(fen)類(lei)單(dan)元，并通過節(jie)點大小反映它們的(de)(de)(de)豐度分(fen)布情況，從(cong)復雜的(de)(de)(de)群落數(shu)據(ju)中快速發現優勢(shi)的(de)(de)(de)微(wei)生(sheng)物類(lei)群
3.2 宏基因組數據分(fen)析
HiSeq平臺共產出3.3Gb宏(hong)基因(yin)組數(shu)據，拼(pin)接(jie)組裝后(hou)的(de)Contigs數(shu)據提交(jiao)到(dao)(dao)MG-RAST進(jin)行(xing)分(fen)析(xi)；共406,305條(tiao)序列通過質(zhi)量控制，并預測得到(dao)(dao)321,789個(ge)蛋白編碼區進(jin)行(xing)后(hou)續分(fen)析(xi)；將這些蛋白通過BLASTX在CAZy數(shu)據庫中進(jin)行(xing)比對(dui)，確定(ding)了32個(ge)最主要的(de)糖苷水解酶類家族(zu)(zu)成員，包(bao)含2058個(ge)候(hou)選基因(yin)，其中豐度最高(gao)的(de)三個(ge)家族(zu)(zu)為GH2、GH3以(yi)及GH43，并最終(zhong)從這些基因(yin)中挑(tiao)選24個(ge)作為克(ke)隆及蛋白表(biao)達分(fen)析(xi)。
32個最主要的糖(tang)苷(gan)水解酶家族，共包含2058個候(hou)選基因
3.3 糖苷水解(jie)酶基因(yin)的克隆表達及特性(xing)研究
被選定的糖苷水(shui)解(jie)酶(mei)基(ji)(ji)因通(tong)過PCR擴增及克隆(long)到(dao)表(biao)達載體的方式引(yin)入到(dao)大腸桿菌等宿主中(zhong)進(jin)行蛋(dan)白表(biao)達，并對細胞裂(lie)解(jie)液(ye)進(jin)行SDS-PAGE電泳，后(hou)續進(jin)行酶(mei)活性檢測；最終挑選出(chu)16個在生(sheng)物質轉化及生(sheng)物制品生(sheng)產中(zhong)存在潛在應用價(jia)值的糖苷水(shui)解(jie)酶(mei)基(ji)(ji)因克隆(long)。
對于(yu)1GH_75-2，1GH_49以(yi)及1GH_368酶的(de)最(zui)適溫(wen)度和pH調查(cha)
4 研(yan)究結論
本研(yan)(yan)究(jiu)描述(shu)了(le)從棉(mian)花種植(zhi)地土壤中(zhong)鑒定(ding)的(de)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)群落參與(yu)粗棉(mian)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)降解(jie)的(de)功能特性(xing)，通過宏基因組學的(de)研(yan)(yan)究(jiu)方法結(jie)合基因克隆、蛋白表達及(ji)酶(mei)活性(xing)測定(ding)等手段(duan)，成功篩選出16個在生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)質(zhi)轉(zhuan)化及(ji)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)制品生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)存在潛在應用(yong)價值的(de)糖(tang)苷水解(jie)酶(mei)類基因，為(wei)研(yan)(yan)究(jiu)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)質(zhi)降解(jie)酶(mei)并結(jie)合生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)實際提供了(le)理論基礎與(yu)研(yan)(yan)究(jiu)思路。
參(can)考文獻
Zhang G, Liu P, Zhang L, et al. Bioprospecting metagenomics of a microbial community on cotton degradation: Mining for new glycoside hydrolases[J]. Journal of Biotechnology, 2016, 234:35-42.
