2024-12-17
蛋(dan)白(bai)質組學本質上指的(de)(de)是(shi)在大(da)規模水平(ping)(ping)上研(yan)究蛋(dan)白(bai)質的(de)(de)特征（一種(zhong)細(xi)胞(bao)乃至一種(zhong)生(sheng)物所表達的(de)(de)全(quan)部蛋(dan)白(bai)質）包括蛋(dan)白(bai)質的(de)(de)表達水平(ping)(ping)，亞細(xi)胞(bao)定位，翻譯后(hou)的(de)(de)修飾，蛋(dan)白(bai)與蛋(dan)白(bai)相互(hu)作用等，由此獲得蛋(dan)白(bai)質水平(ping)(ping)上的(de)(de)關于疾病發生(sheng)、細(xi)胞(bao)代謝、生(sheng)長(chang)發育以及各種(zhong)脅(xie)迫反應等過程的(de)(de)整體而全(quan)面的(de)(de)認識(shi)。
TMT、LFQ和DIA是目前(qian)最常用的(de)三種基于質譜的(de)高通量蛋白(bai)質組學定量方(fang)法。老(lao)師們在(zai)第一次接觸蛋白(bai)質組學的(de)時候，對于不同檢(jian)測原(yuan)理及定量方(fang)式一頭霧水。
什(shen)么是(shi)標記(ji)定(ding)量？什(shen)么是(shi)非(fei)標記(ji)定(ding)量？什(shen)么是(shi)4D蛋白(bai)質(zhi)組？為什(shen)么大家都(dou)在(zai)做Astral-DIA蛋白(bai)質(zhi)組？本次由(you)小派(pai)帶各(ge)位老師走(zou)進蛋白(bai)質(zhi)組學，圍繞(rao)這三種常見檢測技術與一系列(lie)問(wen)題(ti)展開深度解析。
圖1 派森諾蛋白組產品總覽
一、蛋白質組學(xue)常用檢測(ce)技(ji)術盤點
1.TMT（Tandem Mass Tag，串聯質量標簽）
利用TMT標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)試(shi)(shi)劑對肽段進(jin)行標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)，該(gai)類標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)試(shi)(shi)劑結構，由標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)基(ji)(ji)團(tuan)，反應基(ji)(ji)團(tuan)和平衡(heng)基(ji)(ji)團(tuan)構成。不同的(de)標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)試(shi)(shi)劑具有相同的(de)分(fen)(fen)子量，但其含有的(de)標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)基(ji)(ji)團(tuan)分(fen)(fen)子量不同，因此以(yi)不同標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)試(shi)(shi)劑標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)不同樣(yang)品后，混合肽段在(zai)進(jin)入(ru)二級(ji)(ji)質(zhi)譜掃描前，會于碰撞室中(zhong)釋放標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)基(ji)(ji)團(tuan)，并在(zai)二級(ji)(ji)譜圖中(zhong)顯示出不同的(de)標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)基(ji)(ji)團(tuan)信號。根據不同標(biao)(biao)(biao)記(ji)(ji)基(ji)(ji)團(tuan)的(de)信號強度，可(ke)以(yi)獲(huo)得樣(yang)品間同一肽段的(de)定量信息，可(ke)進(jin)一步(bu)轉化為蛋(dan)白(bai)質(zhi)的(de)定量信息。
衍(yan)生產品：TMT標記定量蛋白質組學(xue)（僅限Thermo平(ping)臺）
圖(tu)2 TMT檢測流程
2.LFQ（Label Free Quantification，非標記定量）
廣義(yi)的(de)(de)LFQ技術包括所有不涉及(ji)穩定(ding)(ding)同位素標記的(de)(de)蛋白(bai)質(zhi)組定(ding)(ding)量(liang)(liang)(liang)方法，比如(ru)早期基(ji)于二(er)級譜圖(tu)計數、肽段(duan)(duan)數、各類蛋白(bai)得分進(jin)行(xing)的(de)(de)蛋白(bai)質(zhi)定(ding)(ding)量(liang)(liang)(liang)，或近年來應用(yong)較多的(de)(de)DIA定(ding)(ding)量(liang)(liang)(liang)技術。但狹義(yi)上，LFQ是基(ji)于質(zhi)譜檢測采集(ji)的(de)(de)一(yi)(yi)(yi)級譜圖(tu)和(he)二(er)級譜圖(tu)可分析提取離子(zi)色譜圖(tu)(XIC)，峰面積可用(yong)作反應樣品中相(xiang)對肽段(duan)(duan)乃至蛋白(bai)含量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)定(ding)(ding)量(liang)(liang)(liang)信息(xi)進(jin)行(xing)歸一(yi)(yi)(yi)化處理，即可對不同樣本中檢測到的(de)(de)同一(yi)(yi)(yi)肽段(duan)(duan)乃至蛋白(bai)進(jin)行(xing)相(xiang)對定(ding)(ding)量(liang)(liang)(liang)。
衍生產品：Label free非標記定量蛋白質組學（Thermo）/4D-Label free非標記定量蛋白質組（Bruker）
圖3 Label free檢測流程
3.DIA（Data-Independent Acquisition，數據非(fei)依賴(lai)性采集）
DIA定量(liang)(liang)策略(lve)是一(yi)種非數(shu)據依賴型的(de)質譜數(shu)據采集方(fang)式(shi)，在(zai)目前常用(yong)的(de)大部分(fen)質譜定量(liang)(liang)和鑒定方(fang)法均(jun)采用(yong)的(de)是數(shu)據依賴性(xing)(xing)采集方(fang)式(shi)(DDA)，會(hui)選擇一(yi)級(ji)(ji)譜圖中(zhong)信號(hao)較(jiao)高的(de)離(li)子(zi)進行二級(ji)(ji)質譜掃(sao)(sao)描(miao)，因(yin)而(er)可能損失大量(liang)(liang)低豐度肽(tai)段的(de)信息掃(sao)(sao)描(miao)，隨機性(xing)(xing)也較(jiao)高。而(er)DIA定量(liang)(liang)策略(lve)與(yu)之不同，會(hui)將(jiang)一(yi)級(ji)(ji)質譜檢測到的(de)所有離(li)子(zi)分(fen)段進行二級(ji)(ji)質譜掃(sao)(sao)描(miao)檢測，并根(gen)據二級(ji)(ji)質譜中(zhong)碎片(pian)離(li)子(zi)的(de)信號(hao)強(qiang)度對其相應的(de)肽(tai)段乃至蛋(dan)白進行定量(liang)(liang)。
衍生產品：DIA定量蛋白(bai)(bai)質(zhi)組學（Thermo）/4D-DIA定量蛋白(bai)(bai)質(zhi)組（Bruker）
圖4 DIA檢測流程(cheng)
二、DDA和DIA數據采集(ji)模式區分(fen)
（1）DDA模式下，質譜(pu)根據離(li)子(zi)(zi)化(hua)的肽段母(mu)(mu)離(li)子(zi)(zi)的強度，選擇TopN個（一般20~40）強度最高的離(li)子(zi)(zi)進(jin)入二級質譜(pu)，進(jin)行進(jin)一步碎裂，然(ran)后經過與蛋白質數據庫對比，來鑒定蛋白質。這種方法無疑丟失了大量有(you)用的肽段母(mu)(mu)離(li)子(zi)(zi)信息。
此外，經過二級碎裂的(de)二級譜(pu)圖(tu)，在后期使用軟件鑒定中也僅有少(shao)量譜(pu)圖(tu)得(de)到(dao)解(jie)析（約(yue)30%~50%），大(da)部(bu)分譜(pu)圖(tu)依然得(de)不到(dao)有效利用。由于質譜(pu)選(xuan)擇(ze)離子的(de)隨機性，造(zao)成鑒定的(de)重(zhong)復度較低(di)。又由于空間(jian)電荷(he)的(de)存在，大(da)大(da)限制了分析的(de)動態范(fan)圍，因(yin)而無法解(jie)析一(yi)些重(zhong)要的(de)低(di)豐度蛋白。
（2）DIA技術(shu)具有全景掃描、定(ding)量(liang)準確性高、數據利用度高等優勢，其二級離(li)子(zi)碎(sui)裂(lie)(lie)不(bu)依(yi)賴(lai)于(yu)一級碎(sui)裂(lie)(lie)的(de)結(jie)果(guo)。而是根據質(zhi)(zhi)荷(he)比把(ba)質(zhi)(zhi)譜(pu)掃描范圍分(fen)成若干個窗口，對每(mei)個窗口中所(suo)有的(de)母離(li)子(zi)碎(sui)裂(lie)(lie)并檢測，采集所(suo)有肽段離(li)子(zi)的(de)二級譜(pu)圖信息進行蛋白質(zhi)(zhi)定(ding)性和定(ding)量(liang)。
不(bu)建庫(ku)(ku)的(de)(de)(de)DIA方(fang)(fang)法被稱為DirectDIA或library-free DIA，就是(shi)不(bu)依(yi)賴于(yu)(yu)(yu)DDA檢測(ce)建庫(ku)(ku)的(de)(de)(de)DIA（DDA library-free DIA）。在早期的(de)(de)(de)DIA方(fang)(fang)法中，由(you)于(yu)(yu)(yu)DIA二級譜(pu)(pu)圖(tu)(tu)過于(yu)(yu)(yu)復雜，難以進行譜(pu)(pu)圖(tu)(tu)解析(xi)(xi)(xi)，因此會先使用DDA檢測(ce)建立二級譜(pu)(pu)圖(tu)(tu)庫(ku)(ku)來(lai)輔助譜(pu)(pu)圖(tu)(tu)解析(xi)(xi)(xi)以提取定量(liang)數(shu)(shu)據。這種處理方(fang)(fang)法導致(zhi)了DIA定量(liang)方(fang)(fang)法復雜程(cheng)度(du)的(de)(de)(de)提升，同時也使其定量(liang)數(shu)(shu)據質量(liang)嚴重依(yi)賴于(yu)(yu)(yu)DDA檢測(ce)建立的(de)(de)(de)譜(pu)(pu)圖(tu)(tu)數(shu)(shu)據庫(ku)(ku)，一定程(cheng)度(du)上(shang)難以發揮DIA檢測(ce)的(de)(de)(de)優勢。隨(sui)著近年來(lai)DIA分(fen)析(xi)(xi)(xi)算法的(de)(de)(de)改進和優化，不(bu)依(yi)賴于(yu)(yu)(yu)DDA譜(pu)(pu)圖(tu)(tu)庫(ku)(ku)的(de)(de)(de)DIA定量(liang)分(fen)析(xi)(xi)(xi)算法越(yue)(yue)來(lai)越(yue)(yue)完(wan)善，也得到(dao)越(yue)(yue)來(lai)越(yue)(yue)廣泛地應用。
圖(tu)5 DDA與DIA數(shu)據采集(ji)
三、4D蛋(dan)白組與Astral蛋(dan)白組
（1）4D蛋(dan)白(bai)(bai)質組：專指采用4D質譜(pu)平(ping)(ping)臺(tai)(tai)（Bruker timsTOF系(xi)列）進(jin)行的蛋(dan)白(bai)(bai)組學檢測。為什么會(hui)稱(cheng)為4D呢？因為布(bu)魯克這款質譜(pu)儀在原理上(shang)除了保留時間（retention time）、質荷比（m/z）、離(li)子強度(du)(du)（intensity）之外還(huan)增加了第四維的離(li)子淌度(du)(du)（mobility）的分離(li)。相比傳統(tong)3D平(ping)(ping)臺(tai)(tai)，4D平(ping)(ping)臺(tai)(tai)離(li)子利用率(lv)和準確(que)度(du)(du)更高，能(neng)以更少的上(shang)樣(yang)量，實(shi)現高靈(ling)敏度(du)(du)、高通量、高精(jing)確(que)度(du)(du)的蛋(dan)白(bai)(bai)檢測。
圖6 4D蛋(dan)白(bai)組(zu)平臺檢測優勢
（2）Astral-DIA蛋白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)組：專指采用賽默飛的(de)(de)Orbitrap Astral平臺進行檢測的(de)(de)DIA蛋白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)組。集四極桿質(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)分(fen)析(xi)儀(yi)、Orbitrap質(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)分(fen)析(xi)儀(yi)、Astral質(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)分(fen)析(xi)儀(yi)于一體，完美融(rong)合三大質(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)分(fen)析(xi)器，能(neng)夠快速(su)獲取(qu)高(gao)質(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)、高(gao)分(fen)辨率、高(gao)靈敏度(du)(du)和(he)寬動態范(fan)圍的(de)(de)精(jing)確質(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)（HRAM）數據，最大限度(du)(du)提升解決方案的(de)(de)性(xing)(xing)能(neng)和(he)可用性(xing)(xing)。在檢測通(tong)量(liang)、蛋白(bai)組覆(fu)蓋(gai)深度(du)(du)、靈敏度(du)(du)及精(jing)準定量(liang)等多個維度(du)(du)具有卓越性(xing)(xing)能(neng)。
圖(tu)7 Astral-DIA蛋白組平臺檢測優勢
四、小 結(jie)
各位老師看完以上的知識分(fen)享(xiang)后(hou)，相信大家都是收獲滿滿，綜(zong)上所述，咱們把不同檢(jian)測技術(shu)與平臺匯集成列(lie)表，更加直觀的方(fang)式幫助各位老師理解(jie)并(bing)區(qu)分(fen)各個產(chan)品(pin)。
圖8 不同檢(jian)測技術的(de)區分(fen)（簡(jian)版）
圖9 不同檢測技術的區分(fen)（詳版）
圖10 不同(tong)儀(yi)器平臺比較
