隨(sui)著環(huan)(huan)境污染(ran)問(wen)題的(de)(de)日(ri)益嚴重(zhong)，環(huan)(huan)境微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)變得越來越重(zhong)要。環(huan)(huan)境微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)不僅(jin)對生(sheng)(sheng)態(tai)系(xi)統的(de)(de)平衡起著關鍵作(zuo)用(yong)，而且一些致病微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)還會對人類健康造成威脅。傳統的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)檢(jian)(jian)測(ce)方(fang)法(fa)如培(pei)養法(fa)、顯微(wei)(wei)(wei)鏡(jing)觀察法(fa)等(deng)存在操作(zuo)繁瑣、耗時較長、靈敏度(du)低等(deng)缺點。而 ELISA（酶聯免疫吸附測(ce)定） 作(zuo)為一種快(kuai)速(su)、靈敏、特異性強的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)技術，在環(huan)(huan)境微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)檢(jian)(jian)測(ce)中得到了廣泛的(de)(de)應用(yong)。

一、Elisa檢測(ce)技術(shu)原理

酶聯免疫(yi)吸附測(ce)定(ding)（ELISA），指將可溶性(xing)的抗原或抗體(ti)結(jie)合(he)到聚苯乙烯等固(gu)相載體(ti)上，利用抗原與抗體(ti)特異性(xing)結(jie)合(he)進行免疫(yi)反(fan)應的定(ding)性(xing)和(he)(he)定(ding)量檢(jian)測(ce)方法。最早是(shi)由瑞(rui)典學(xue)者 Engvail 和(he)(he) Perlmann，荷(he)蘭學(xue)者 Van Weerman 和(he)(he) Schuurs 于 1971 年報道的一(yi)項成果(guo)。

ELISA 的基(ji)本原理(li)有(you)三條：

1、抗原或抗體能以(yi)物(wu)理(li)性(xing)地吸附(fu)于固相(xiang)載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的(de)疏水性(xing)部分相(xiang)互吸附(fu)，并保(bao)持其免疫學活性(xing)；

2、抗(kang)原(yuan)或(huo)抗(kang)體可(ke)通過共價鍵與酶(mei)連(lian)接形成酶(mei)結(jie)合物(wu)，而此(ci)種酶(mei)結(jie)合物(wu)仍能(neng)保(bao)持其(qi)免疫學(xue)和酶(mei)學(xue)活(huo)性；

3、酶結(jie)合(he)物與(yu)相(xiang)應(ying)抗(kang)原或(huo)抗(kang)體結(jie)合(he)后，可(ke)根據(ju)加入底(di)物的(de)(de)顏色(se)反應(ying)來判定是否有免疫反應(ying)的(de)(de)存在，而且顏色(se)反應(ying)的(de)(de)深淺是與(yu)標本中相(xiang)應(ying)抗(kang)原或(huo)抗(kang)體的(de)(de)量成正比(bi)例的(de)(de)，因此(ci)，可(ke)以(yi)按底(di)物顯色(se)的(de)(de)程(cheng)度顯示試驗結(jie)果。

ELISA 可用于測(ce)(ce)定(ding)(ding)抗(kang)原，也可用于測(ce)(ce)定(ding)(ding)抗(kang)體。常見(jian)測(ce)(ce)抗(kang)原的方(fang)法有(you)雙(shuang)抗(kang)體夾(jia)心(xin)(xin)法、雙(shuang)位(wei)點一(yi)步(bu)法；測(ce)(ce)抗(kang)體的方(fang)法有(you)間接(jie)法、雙(shuang)抗(kang)原夾(jia)心(xin)(xin)法；既(ji)可測(ce)(ce)抗(kang)原又(you)可測(ce)(ce)抗(kang)體的方(fang)法有(you)捕獲法、競爭法。

二、ELISA 在環(huan)境微生物(wu)檢測中的(de)應用

1、水質(zhi)檢測

檢測(ce)水中(zhong)(zhong)的(de)細菌和病(bing)毒：快速檢測(ce)水中(zhong)(zhong)的(de)大腸桿(gan)菌、霍亂弧菌、脊髓(sui)灰質炎病(bing)毒等致(zhi)病(bing)微生物，為水質監測(ce)和飲用水安(an)全提(ti)供保(bao)障。

檢測水(shui)(shui)中的藻類和藍(lan)細(xi)菌：檢測水(shui)(shui)中的微囊藻毒(du)素、節球藻毒(du)素等藻類毒(du)素，以(yi)及藍(lan)細(xi)菌產生的肝毒(du)素和神經(jing)毒(du)素，為水(shui)(shui)環(huan)境(jing)生態風險評估提(ti)供依據。

2、土壤檢(jian)測

檢測(ce)(ce)土(tu)(tu)壤(rang)中(zhong)的病原(yuan)(yuan)菌(jun)：檢測(ce)(ce)土(tu)(tu)壤(rang)中(zhong)的真菌(jun)、細菌(jun)和(he)病毒等病原(yuan)(yuan)菌(jun)，如根(gen)腐(fu)病菌(jun)、青枯病菌(jun)、煙草(cao)花(hua)葉病毒等，為土(tu)(tu)壤(rang)病害(hai)的診斷和(he)防(fang)治提供(gong)支持。

檢(jian)測土(tu)壤中(zhong)的有益微生物：檢(jian)測土(tu)壤中(zhong)的固氮菌、解磷菌、硅(gui)酸鹽細(xi)菌等有益微生物，為土(tu)壤肥力(li)的評價和改(gai)良提供參考。

3、空氣檢測

檢測(ce)空(kong)(kong)(kong)氣中的(de)真(zhen)菌(jun)(jun)和細菌(jun)(jun)：檢測(ce)空(kong)(kong)(kong)氣中的(de)曲(qu)霉、青霉、葡(pu)萄球(qiu)菌(jun)(jun)等真(zhen)菌(jun)(jun)和細菌(jun)(jun)，為室內空(kong)(kong)(kong)氣質量監測(ce)和空(kong)(kong)(kong)氣污(wu)染控制(zhi)提供手段。

檢測(ce)空(kong)氣中的(de)花(hua)粉和(he)過敏(min)原：檢測(ce)空(kong)氣中的(de)花(hua)粉、塵螨、動物皮屑等過敏(min)原，為過敏(min)性(xing)疾病的(de)預(yu)防和(he)治療提供依(yi)據。

三(san)、Elisa檢測環(huan)境(jing)微(wei)生物的優勢

1、高靈敏度與特(te)異(yi)性

ELISA 能夠(gou)檢(jian)(jian)測(ce)低濃度的(de)目標(biao)抗(kang)原(yuan)或(huo)抗(kang)體，即使(shi)是在復(fu)雜的(de)環(huan)境(jing)樣本中(zhong)，也能準(zhun)確地區分(fen)和測(ce)量(liang)特定(ding)的(de)分(fen)子，這是由于(yu)抗(kang)體對抗(kang)原(yuan)的(de)高度特異性所決(jue)定(ding)的(de)。例如在環(huan)境(jing)科學領域，ELISA 技術(shu)被(bei)用于(yu)檢(jian)(jian)測(ce)環(huan)境(jing)污染物的(de)殘留量(liang)、水體中(zhong)病(bing)原(yuan)微生物的(de)檢(jian)(jian)測(ce)等，能夠(gou)準(zhun)確地檢(jian)(jian)測(ce)出微量(liang)的(de)目標(biao)分(fen)子。

2、應用范圍廣泛(fan)

ELISA 被廣泛應用(yong)于(yu)(yu)多個領(ling)(ling)域，包括臨床(chuang)醫學，可(ke)用(yong)于(yu)(yu)疾(ji)病診斷(duan)，如 HIV、乙(yi)肝、丙肝、梅毒等(deng)傳染病的(de)篩查(cha)；科學研(yan)究(jiu)中可(ke)用(yong)于(yu)(yu)基礎免疫學、生(sheng)物標記物探索、藥(yao)物作用(yong)機制研(yan)究(jiu)；在環(huan)境保護方面，可(ke)用(yong)于(yu)(yu)水質、土壤污染的(de)監測(ce)，重金屬、農(nong)(nong)藥(yao)殘(can)留(liu)的(de)檢測(ce)；食(shi)品安全領(ling)(ling)域可(ke)用(yong)于(yu)(yu)食(shi)品添加劑(ji)、過敏(min)源、病原微生(sheng)物的(de)檢測(ce)；農(nong)(nong)獸醫領(ling)(ling)域可(ke)用(yong)于(yu)(yu)動植物疫病監控(kong)，飼料、藥(yao)品殘(can)留(liu)分析。

3、操作流程(cheng)簡便、快速、標準化

ELISA 試劑盒通常包含完整的檢測組件，操作(zuo)(zuo)步驟標準化，易于培(pei)訓(xun)和(he)執行，即便是沒(mei)有(you)(you)豐(feng)富實驗經(jing)驗的人(ren)員也(ye)能順利進(jin)行檢測。例如在食品(pin)微生物(wu)檢測中，酶聯(lian)免疫吸附(fu)（ELISA）法(fa)以顯色為(wei)依據實現檢測，形成(cheng)了具(ju)有(you)(you)特殊性的分析方法(fa)，操作(zuo)(zuo)流程相對(dui)簡便。

4、可自動化(hua)

ELISA 可以與自(zi)動化設備配合使(shi)用，大(da)(da)大(da)(da)提升(sheng)了檢測(ce)(ce)效率(lv)(lv)和(he)通量，適合大(da)(da)規模篩(shai)查和(he)高頻率(lv)(lv)監測(ce)(ce)場合。在環(huan)境(jing)微生物檢測(ce)(ce)中，與自(zi)動化設備配合能夠快速處理(li)大(da)(da)量樣(yang)本，提高檢測(ce)(ce)效率(lv)(lv)。

5、數據(ju)量化分析(xi)

ELISA 提供(gong)了定(ding)量分析的可(ke)能(neng)性，通(tong)過(guo)標(biao)準(zhun)(zhun)曲線可(ke)以直接計(ji)算出待測(ce)物質的濃(nong)度，為(wei)后續的數(shu)據統計(ji)和(he)深入研究(jiu)奠定(ding)基礎(chu)。在環境(jing)微生(sheng)物檢測(ce)中，能(neng)夠準(zhun)(zhun)確(que)地確(que)定(ding)待測(ce)物質的濃(nong)度，為(wei)環境(jing)評估提供(gong)有力的數(shu)據支(zhi)持。

6、穩(wen)定性(xing)和重復(fu)性(xing)佳(jia)

只要(yao)遵(zun)循正(zheng)確(que)的(de)儲存和(he)(he)操作(zuo)指(zhi)導，ELISA 試劑盒(he)能(neng)夠保(bao)證檢(jian)測(ce)結果的(de)穩定性和(he)(he)一(yi)致性，利(li)于長時間(jian)內的(de)數據比較(jiao)和(he)(he)跨實驗室間(jian)的(de)交流，穩定的(de)檢(jian)測(ce)結果有助于科(ke)學研究的(de)準確(que)性和(he)(he)可靠性。

四、環境(jing)微(wei)生(sheng)物(wu)的 Elisa 檢測步驟

• 包被(bei)過程，將所用抗(kang)原(yuan)用包被(bei)稀釋液稀釋到適當濃度，加(jia)入到酶標反應孔(kong)中(zhong)，置特定溫度和時(shi)間。

具(ju)體操作：一(yi)般所需(xu)抗原包被量(liang)為每孔 20 - 200μg，每孔抗原加入 100μl，置(zhi) 37℃，4h，或 4℃，24h。為避免蒸發，板上(shang)應加蓋(gai)或將板平放在底部有濕(shi)紗布的金(jin)屬濕(shi)盒(he)中。同時注(zhu)意設置(zhi)空白對(dui)照(zhao)和(he)陰性對(dui)照(zhao)。

• 封閉(bi)酶標反應孔，加入 5% 小(xiao)牛血(xue)清，置(zhi)特(te)定(ding)溫度封閉(bi)一(yi)定(ding)時間，然后用洗(xi)滌液洗(xi)滌。

5% 小牛血清(qing)置 37℃封閉(bi) 40min。封閉(bi)時將封閉(bi)液(ye)加滿各反應孔(kong)，并去除各孔(kong)中(zhong)的氣泡，封閉(bi)結束后(hou)用洗滌(di)液(ye)滿孔(kong)洗滌(di) 3 遍，每遍 3min。洗滌(di)方(fang)法(fa)為(wei)吸干孔(kong)內(nei)反應液(ye)，將洗滌(di)液(ye)注(zhu)滿板孔(kong)，放置 2min 略(lve)作搖動，吸干孔(kong)內(nei)液(ye)，傾去液(ye)體(ti)后(hou)在吸水(shui)紙上拍(pai)干。

• 加入待檢測(ce)樣品，建立合(he)適的濃度(du)梯度(du)，置(zhi)于特定溫(wen)度(du)和時間，用洗滌液洗滌。

檢測時一(yi)般采用 1:50 - 1:400 的稀(xi)釋度，應采用較大稀(xi)釋體(ti)積進行，一(yi)般保證樣品吸取量＞20μl。將(jiang)稀(xi)釋好的樣品加入酶標(biao)反(fan)應孔中，每(mei)(mei)(mei)樣品至少加雙孔，每(mei)(mei)(mei)孔 100μl，置(zhi)于(yu) 37℃，40 - 60min。用洗(xi)滌液(ye)滿孔洗(xi)滌 3 遍(bian)，每(mei)(mei)(mei)遍(bian) 3min。

• 加(jia)入酶標抗體，根據參(can)考工作稀釋(shi)度進行，置特定溫(wen)度和時(shi)間(jian)，洗(xi)滌同前。

酶標抗體根據酶結合(he)物提供商提供的參考工作稀釋度(du)進行(xing)。37℃，30 - 60min 之間。短于 30min 往往結果不穩(wen)定。每(mei)孔加 100μl。洗滌方法與前(qian)面(mian)步(bu)驟(zou)相同。

• 加入(ru)底物(wu)液(ye)，現用現配(pei)，置特定溫度和時間，加入(ru)終(zhong)止(zhi)液(ye)顯(xian)色。

首選 TMB - 過氧化氫尿素溶液，OPD - 過氧化氫底物(wu)液系統(tong)次之(zhi)。底物(wu)加入量(liang)為每孔 100μl，置(zhi) 37℃避(bi)光(guang)放(fang)置(zhi) 3 - 5 分鐘，加入終止液顯色。

• 終止反應(ying)，每孔加入終止液，于(yu)一(yi)定時間內測定實驗結(jie)果。

每(mei)孔(kong)加入終止液 50μl 終止反應，于(yu) 20min 內測定實(shi)驗結果。

• 結果(guo)判斷，根據(ju)特定波長讀數(shu)，用酶聯免疫(yi)檢測儀記錄(lu)數(shu)據(ju)。

OPD 顯(xian)色后采用 492nm 波長，TMB 反應(ying)產物檢測需(xu)要(yao) 450nm 波長。檢測時(shi)一(yi)定(ding)要(yao)首先進行(xing)空白孔系統調零。用測定(ding)標(biao)本孔的(de)吸收(shou)值與一(yi)組陰性標(biao)本測定(ding)孔平均(jun)值的(de)比值（P/N）表示，當 P/N 大(da)于 2 時(shi)作為抗體(ti)的(de)效價(jia)。（數值的(de)大(da)小依具(ju)體(ti)檢測要(yao)求而定(ding)。）

五、微(wei)生物 ELISA 試劑(ji)盒檢測(ce)法(fa)的注意事項

1、樣本采集和處(chu)理方面

正確選擇樣品類型：微生物 ELISA 試劑盒(he)檢測(ce)適用于多種樣品類型，如在食品中(zhong)微生物檢測(ce)可選擇(ze)食物樣品、環(huan)境(jing)表面等(deng)；在水質中(zhong)微生物檢測(ce)可選擇(ze)自來水、廢水等(deng)。需根據具體需要和實驗目的進行判(pan)斷。

正確采集樣品：采集樣品(pin)時應注意操作的(de)(de)無菌性，使(shi)用消毒的(de)(de)工具和容器，選擇適(shi)當的(de)(de)采樣方法，并(bing)將樣品(pin)存放在恰當條件下，以確保樣品(pin)的(de)(de)原始狀態，避(bi)免因污染引入外源性微生物(wu)。

正確處理樣品：樣品采集后，需根(gen)據不同(tong)試劑盒要求進行(xing)(xing)適當處理。一般要進行(xing)(xing)稀釋或濃縮，并(bing)通(tong)過超濾、離心等方法去除雜質和固體顆(ke)粒(li)，提(ti)高(gao)檢測準(zhun)確性(xing)。

2、試劑和(he)儀器使用(yong)方面

合理(li)儲存試劑：試劑的(de)儲存條件至關重要(yao)，應(ying)按照(zhao)要(yao)求儲存于適當的(de)溫度(du)(du)、濕(shi)度(du)(du)和(he)光照(zhao)條件下，避免因溫度(du)(du)過高或(huo)過低、濕(shi)度(du)(du)變(bian)化或(huo)陽光照(zhao)射等導致試劑性能下降。

正(zheng)確配(pei)置試劑：試劑(ji)盒中的試劑(ji)需(xu)以適(shi)當(dang)比例配置，嚴格按(an)照說(shuo)明(ming)書(shu)中的方法和比例進行操作，避免配置錯誤導致結果錯誤。

正確使用儀器：使(shi)用特定儀器(qi)進行操(cao)作前(qian)，應仔細閱讀操(cao)作手冊，正確設(she)置和操(cao)作儀器(qi)，確保其處于(yu)正常(chang)工(gong)作狀(zhuang)態。

3、實驗操(cao)作(zuo)方面

嚴(yan)格(ge)遵守實(shi)驗步驟：微生物 ELISA 試(shi)劑盒檢測有特定操(cao)作步(bu)(bu)驟(zou)和順序(xu)，必須嚴格按(an)照試(shi)劑盒說明(ming)書進行(xing)操(cao)作，任(ren)何不(bu)按(an)步(bu)(bu)驟(zou)的操(cao)作都可能影(ying)響結果準確(que)性(xing)，甚至導致錯誤。

注意實驗操作的(de)無(wu)菌性(xing)：實驗操作需保(bao)持嚴格(ge)無(wu)菌(jun)性，使用無(wu)菌(jun)的試(shi)劑、器具和操作臺面(mian)，避免雜(za)質干(gan)擾或外(wai)源性微生物污染。

嚴格控(kong)制試(shi)劑(ji)和反(fan)應時(shi)間(jian)：試劑(ji)(ji)加入量(liang)和反應時間的(de)控(kong)制(zhi)對結(jie)果準(zhun)確性和可(ke)重(zhong)復性至關(guan)重(zhong)要，應根據試劑(ji)(ji)盒說明(ming)書要求嚴格控(kong)制(zhi)，避(bi)免過量(liang)或(huo)不足(zu)的(de)反應影響結(jie)果準(zhun)確性。

4、結果解讀方面

了解結果的含義：得到實驗結(jie)(jie)果后，需根據所檢(jian)測(ce)微生物的特性(xing)和試劑盒(he)說明了解結(jie)(jie)果含義，對于陽性(xing)樣品，要根據相應標準和閾值判斷結(jie)(jie)果的陰性(xing)或陽性(xing)。

與其他(ta)檢測方法對比：微生物(wu)(wu) ELISA 試劑(ji)盒檢(jian)測結(jie)果應與其(qi)他可(ke)靠(kao)的微生物(wu)(wu)檢(jian)測方法進行對(dui)比，如傳統培(pei)養(yang)方法或 PCR 方法等，以驗證結(jie)果的準確性和可(ke)靠(kao)性。

六、小 結

ELISA 作(zuo)(zuo)為一種快速、靈敏、特(te)異性強的檢(jian)測(ce)技術(shu)，在環境(jing)微生(sheng)物檢(jian)測(ce)中(zhong)具有廣闊(kuo)的應用前景。隨(sui)著技術(shu)的不(bu)斷發展和(he)完善(shan)，ELISA 將(jiang)在環境(jing)監測(ce)、生(sheng)態風險評(ping)估、疾病預(yu)防(fang)和(he)控制等領域發揮越來越重要(yao)的作(zuo)(zuo)用。派森諾竭誠為大家提供Elisa檢(jian)測(ce)實驗中(zhong)涉(she)及的各(ge)類試(shi)劑(ji)、耗材和(he)設備，助力(li)每一位生(sheng)命科學實驗室的科研人收(shou)獲屬于自己的完美實驗結果，逐夢高分(fen)文章~

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