RNA Velocity（RNA速率分(fen)析(xi)(xi)）是(shi)(shi)一種能夠重(zhong)塑(su)RNA轉錄、剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)與降解過程(cheng)的(de)(de)(de)(de)動(dong)(dong)力(li)學分(fen)析(xi)(xi)方法(fa)，通過比較未(wei)剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)的(de)(de)(de)(de)前(qian)體mRNA和(he)剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)后成熟mRNA的(de)(de)(de)(de)相對含量，來分(fen)析(xi)(xi)mRNA的(de)(de)(de)(de)剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)和(he)降解速率。根據剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)前(qian)后mRNA豐度的(de)(de)(de)(de)動(dong)(dong)態變(bian)(bian)化，可以預測(ce)單(dan)細(xi)胞(bao)轉錄狀態的(de)(de)(de)(de)變(bian)(bian)化趨勢和(he)細(xi)胞(bao)命運。目前(qian)常用的(de)(de)(de)(de)轉錄組分(fen)析(xi)(xi)方法(fa)是(shi)(shi)基于(yu)Oligo-dT引物捕(bu)獲Poly(A)尾的(de)(de)(de)(de)mRNA，主(zhu)要檢(jian)測(ce)和(he)分(fen)析(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)之后的(de)(de)(de)(de)RNA，而忽略了細(xi)胞(bao)中(zhong)未(wei)剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)RNA的(de)(de)(de)(de)信息。因此(ci)，同時分(fen)析(xi)(xi)單(dan)細(xi)胞(bao)中(zhong)剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)與未(wei)剪(jian)(jian)(jian)(jian)接(jie)(jie)(jie)(jie)的(de)(de)(de)(de)RNA能夠更精準(zhun)地重(zhong)塑(su)單(dan)細(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)RNA動(dong)(dong)力(li)學過程(cheng)。

2024年7月，美國(guo)貝(bei)勒醫(yi)學院的Chenghang Zong在(zai)Nature Communications雜志在(zai)線(xian)發表(biao)題為(wei)“Single-cell total-RNA profiling unveils regulatory hubs of transcription factors”研(yan)究論文。本研(yan)究提(ti)出了一(yi)種基于多重退火循環擴增引物的單細胞(bao)SnapTotal-seq測序(xu)方法，具有同時(shi)檢測單細胞(bao)中前體RNA與(yu)剪接后(hou)RNA的能力。

技術(shu)原理(li)

文(wen)中開發了(le)(le)SnapTotal-seq方法，可(ke)(ke)以進行(xing)(xing)單(dan)細(xi)胞(bao)的(de)全轉(zhuan)錄(lu)組(zu)測序(xu)。如(ru)圖(tu)1a，SnapTotal-seq使用(yong)了(le)(le)多重(zhong)退火循環擴增的(de)引(yin)物，在(zai)低溫下(xia)可(ke)(ke)實(shi)現(xian)引(yin)物與單(dan)細(xi)胞(bao)中RNA的(de)隨機結合，逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)后引(yin)物序(xu)列離開RNA，實(shi)現(xian)模板轉(zhuan)換，并進行(xing)(xing)后續的(de)文(wen)庫(ku)構(gou)建(jian)，使用(yong)了(le)(le)Cell Barcodes與UMI來進行(xing)(xing)細(xi)胞(bao)和分(fen)(fen)子的(de)區(qu)分(fen)(fen)與計數。在(zai)1 M reads的(de)深度下(xia)，SnapTotal-seq基(ji)于外顯子與內含子的(de)reads都能夠檢測到(dao)一(yi)萬多種基(ji)因，說明(ming)此方法可(ke)(ke)高(gao)效捕獲到(dao)剪接與未剪接的(de)RNA（如(ru)圖(tu)1b）。利用(yong)RNA Velocity分(fen)(fen)析，SnapTotal-seq成功重(zhong)構(gou)了(le)(le)293T細(xi)胞(bao)的(de)細(xi)胞(bao)周(zhou)(zhou)期動(dong)態（G2/M→G1→S→G2/M）。與其他單(dan)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)技術(shu)相比，SnapTotal-seq在(zai)細(xi)胞(bao)周(zhou)(zhou)期動(dong)態轉(zhuan)化的(de)重(zhong)構(gou)上(shang)優于基(ji)于Poly(A)尾RNA捕獲的(de)CEL-seq2和Smart-seq3，而與VASA-seq相當，后者也能較為精確地重(zhong)構(gou)細(xi)胞(bao)周(zhou)(zhou)期動(dong)態。

圖1 SnapTotal-seq方法及其(qi)效果驗證

實(shi)驗(yan)結果

1、確(que)定細(xi)胞(bao)周期進程中(zhong)的差異表達基因

研(yan)究(jiu)根據(ju)細胞(bao)周期中(zhong)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)達的(de)變(bian)(bian)化(hua)(hua)(hua)，將差(cha)(cha)(cha)異(yi)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)分為三(san)類：Type I、Type II和(he)Type III。Type I基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)外顯(xian)子和(he)內含子的(de)reads豐度(du)上都有(you)(you)顯(xian)著變(bian)(bian)化(hua)(hua)(hua)，可能(neng)由轉錄過(guo)程調控；Type II基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)只有(you)(you)剪(jian)接(jie)后的(de)RNA存在(zai)顯(xian)著變(bian)(bian)化(hua)(hua)(hua)；Type III基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)則僅未剪(jian)接(jie)的(de)RNA有(you)(you)顯(xian)著變(bian)(bian)化(hua)(hua)(hua)，可能(neng)由轉錄后的(de)RNA剪(jian)接(jie)或修飾過(guo)程調控。進一步(bu)分析(xi)發現(xian)，Type I基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)不同細胞(bao)狀(zhuang)態中(zhong)的(de)表(biao)達變(bian)(bian)化(hua)(hua)(hua)分為五種模式，剪(jian)接(jie)和(he)未剪(jian)接(jie)RNA的(de)變(bian)(bian)化(hua)(hua)(hua)具有(you)(you)較強的(de)相關(guan)性，且兩者變(bian)(bian)化(hua)(hua)(hua)存在(zai)微小(xiao)的(de)延(yan)遲。為驗證差(cha)(cha)(cha)異(yi)表(biao)達基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)與細胞(bao)周期的(de)關(guan)系，研(yan)究(jiu)人(ren)員通過(guo)qRT-PCR檢測了(le)G1、S/G2、G2/M時期細胞(bao)中(zhong)的(de)8個Type I基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，結果表(biao)明這些(xie)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)表(biao)達差(cha)(cha)(cha)異(yi)與細胞(bao)周期密切相關(guan)。研(yan)究(jiu)還發現(xian)，超過(guo)50%的(de)Type I基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)是尚未被報道的(de)細胞(bao)周期相關(guan)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，這些(xie)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)主要參(can)與有(you)(you)機氮化(hua)(hua)(hua)合物的(de)合成和(he)碳水化(hua)(hua)(hua)合物代(dai)謝等細胞(bao)功能(neng)通路。

圖2 I型細胞(bao)周(zhou)期基(ji)因（CCGs）的功能分(fen)析

2、鑒定(ding)細胞周期進(jin)程中的(de)關鍵轉錄因(yin)子(zi)

Type Ⅰ的(de)基(ji)因(yin)隨(sui)著(zhu)細胞(bao)(bao)周期表(biao)(biao)達的(de)變(bian)化很可能是由于(yu)DNA到RNA的(de)轉(zhuan)錄(lu)(lu)過程影響(xiang)的(de)，而調控(kong)(kong)轉(zhuan)錄(lu)(lu)過程的(de)一(yi)個(ge)重要因(yin)素是轉(zhuan)錄(lu)(lu)因(yin)子（Transcriptional Factor, TF）——一(yi)種通過與(yu)DNA相(xiang)互作(zuo)用在轉(zhuan)錄(lu)(lu)水(shui)平參與(yu)基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達調控(kong)(kong)的(de)蛋白質。為了篩選(xuan)出調節細胞(bao)(bao)周期進程的(de)關(guan)鍵TF，利用回歸算法研(yan)究TF的(de)剪接后RNA表(biao)(biao)達水(shui)平與(yu)靶(ba)基(ji)因(yin)未(wei)剪接RNA轉(zhuan)錄(lu)(lu)水(shui)平的(de)相(xiang)關(guan)性(xing)(xing)，檢測(ce)出Type I中的(de)23個(ge)TF的(de)潛在下游的(de)靶(ba)基(ji)因(yin)，根據靶(ba)基(ji)因(yin)的(de)轉(zhuan)錄(lu)(lu)活性(xing)(xing)分(fen)成(cheng)4個(ge)Hub（圖3a-d）。使用LASSO 回歸分(fen)析鑒定23個(ge)TF之(zhi)間的(de)互相(xiang)調控(kong)(kong)作(zuo)用（圖3e）。

圖3 重(zhong)建(jian)細胞周期轉錄因(yin)子（TF）調控(kong)網絡(luo)

3、鑒定(ding)細胞周期進(jin)程中(zhong)的關鍵RNA結合蛋(dan)白

Type II基(ji)因(yin)的(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)主要(yao)受(shou)轉錄(lu)后調節的(de)控制，表(biao)(biao)(biao)現為RNA豐(feng)度(du)差異(yi)。根據這些(xie)基(ji)因(yin)的(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)活(huo)(huo)性(xing)變化，作者將(jiang)其分(fen)(fen)為五種(zhong)(zhong)(zhong)動力(li)學表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)模式，并對每種(zhong)(zhong)(zhong)模式進行(xing)了GO富集分(fen)(fen)析(xi)。研究(jiu)發現，RNA結合蛋白（RBPs）在調控Type II基(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)中起著重要(yao)作用(yong)，特別是(shi)有(you)8種(zhong)(zhong)(zhong)RBPs與(yu)Type II基(ji)因(yin)的(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)相(xiang)關(guan)。進一步分(fen)(fen)析(xi)發現，增強(qiang)RNA穩定性(xing)的(de)BCLAF1和G3BP1與(yu)其靶基(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)呈正相(xiang)關(guan)，而(er)促進RNA降解的(de)PUM1與(yu)其靶基(ji)因(yin)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)呈負相(xiang)關(guan)。由(you)于PUM1和G3BP1在細胞周期中的(de)作用(yong)，這兩個基(ji)因(yin)的(de)敲(qiao)除會導致細胞存(cun)活(huo)(huo)率顯著下降。

圖(tu)4 II型細胞周期(qi)基因（CCGs）的轉錄后調控

4、確定OIS進程中的差(cha)異表達基因(yin)與轉(zhuan)錄因(yin)子調控網(wang)絡

接(jie)下來，作(zuo)者將SnapTotal-seq應用于(yu)對腫瘤基(ji)因誘導的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)衰老死(si)亡(wang)過程(cheng)（Oncogene-Induced Senescence, OIS）的(de)(de)(de)(de)(de)研究中(zhong)（圖5a）。通過誘導胰腺癌Oncogene KRASG12D的(de)(de)(de)(de)(de)表達，并(bing)收集0、1、2、3、5天的(de)(de)(de)(de)(de)人胰腺導管細(xi)(xi)胞(bao)進行SnapTotal-seq分(fen)析。由細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)群(qun)結(jie)果(guo)可知，在KRASG12D基(ji)因表達之后(hou)細(xi)(xi)胞(bao)逐漸進入G0期（圖5b-d）。與(yu)前文的(de)(de)(de)(de)(de)思路類似，作(zuo)者依照剪接(jie)與(yu)未剪接(jie)RNA豐(feng)度(du)變(bian)化(hua)將差異(yi)基(ji)因分(fen)成三(san)種類型(xing)，并(bing)詳細(xi)(xi)研究其(qi)中(zhong)Type Ⅰ基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)表達豐(feng)度(du)變(bian)化(hua)（圖5e-g），選(xuan)出了112個可能的(de)(de)(de)(de)(de)TF，并(bing)根據(ju)TF的(de)(de)(de)(de)(de)活(huo)性分(fen)為3個Hub。其(qi)中(zhong)Hub2與(yu)其(qi)他Hub具有(you)更多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)上下游調(diao)控關(guan)系，說明Hub2在細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)狀(zhuang)態轉變(bian)中(zhong)可能起到比較關(guan)鍵的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用（圖5h-j）。

圖5 癌基因誘導(dao)衰老(lao)過程中的轉錄動力學(xue)

5、鑒定(ding)OIS進程中的關鍵轉錄因子

為了(le)得到更有(you)(you)(you)說服力的(de)(de)結果，文章參考了(le)ChIP-seq數據庫，發現112個(ge)(ge)TF中(zhong)有(you)(you)(you)25個(ge)(ge)TF的(de)(de)下游(you)靶基(ji)因(yin)也(ye)在(zai)ChIP-seq中(zhong)被(bei)顯(xian)著富(fu)集（圖(tu)6a）。其(qi)中(zhong)，隨著細胞進入G0期，Hub3的(de)(de)靶基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)(da)越(yue)來越(yue)活躍(yue)，根據靶基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)(da)表(biao)(biao)達(da)(da)的(de)(de)活躍(yue)程(cheng)度(du)，Hub3的(de)(de)TF進一(yi)步被(bei)分為兩個(ge)(ge)亞(ya)類(lei)，兩個(ge)(ge)亞(ya)類(lei)的(de)(de)靶基(ji)因(yin)分別作用于(yu)免疫反應(ying)(ying)和(he)應(ying)(ying)激反應(ying)(ying)的(de)(de)調(diao)節(jie)，說明(ming)了(le)不同TF在(zai)腫瘤基(ji)因(yin)誘導的(de)(de)衰老死(si)亡中(zhong)具有(you)(you)(you)獨(du)特的(de)(de)功能。通過(guo)TF調(diao)控(kong)網(wang)絡(luo)的(de)(de)構(gou)建(jian)：發現Hub3.1調(diao)控(kong)網(wang)絡(luo)與Hub2中(zhong)的(de)(de)TF有(you)(you)(you)關；而Hub3.2的(de)(de)調(diao)控(kong)網(wang)絡(luo)中(zhong)，ATF4是上(shang)游(you)TF，級聯(lian)的(de)(de)調(diao)控(kong)網(wang)絡(luo)說明(ming)了(le)ATF4在(zai)細胞的(de)(de)應(ying)(ying)激反應(ying)(ying)通路中(zhong)具有(you)(you)(you)核(he)心(xin)作用（圖(tu)6b-e）。

圖6 識(shi)別推動OIS的關鍵(jian)TF監管(guan)網(wang)絡

總 結

研(yan)究中(zhong)通過(guo)將多(duo)重退火化(hua)(hua)學(xue)和(he)(he)模板切換化(hua)(hua)學(xue)結合到一步反(fan)應(ying)中(zhong)，開發(fa)了一種高(gao)靈敏度的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)細胞總RNA-seq方法(fa)（snapTotal-seq）。與基于寡核(he)苷酸的(de)(de)(de)(de)(de)方法(fa)相比，通過(guo)有效(xiao)檢測未剪接(jie)RNA和(he)(he)剪接(jie)RNA，snapTotal-seq在重建細胞周期進(jin)展的(de)(de)(de)(de)(de)潛(qian)在動態過(guo)程方面顯示出(chu)顯著的(de)(de)(de)(de)(de)優勢(shi)。該(gai)技(ji)術可(ke)以提(ti)升(sheng)RNA速率(lv)的(de)(de)(de)(de)(de)分析效(xiao)果，較(jiao)為(wei)精確地重構細胞周期的(de)(de)(de)(de)(de)動態變化(hua)(hua)。snapTotal-seq的(de)(de)(de)(de)(de)開發(fa)和(he)(he)應(ying)用為(wei)基因調控研(yan)究提(ti)供了新的(de)(de)(de)(de)(de)工具和(he)(he)方法(fa)，其在細胞周期和(he)(he)抗癌研(yan)究中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)成功(gong)應(ying)用展示了其巨(ju)大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)潛(qian)力。