2018-01-05
2017年剛剛過去，在這一年中，派森諾生物與中科院廣東微生物研究所合作開展了多項研究，已在《Frontiers in Immunology》和《Oncotarget》上相繼發表研究成果。在此基礎上，最新研究又以嚙齒動物為模型，探索巴戟天低聚果糖對阿爾茲海默的益生元功效，并揭示菌群-腸-腦軸在此過程中的作用，研究成果順利發表于《Frontiers in Aging Neuroscience》（最新影響因子:4.504）。
1 研究背景
腸道菌群和很多疾病(bing)(bing)相關(guan)，包括神(shen)經(jing)(jing)性(xing)疾病(bing)(bing)，例如帕金森病(bing)(bing)（PD）和阿茲(zi)海(hai)默病(bing)(bing)（AD）。AD是最常(chang)見的(de)(de)中樞神(shen)經(jing)(jing)系統紊亂性(xing)疾病(bing)(bing)，屬(shu)于一種慢(man)性(xing)神(shen)經(jing)(jing)退行性(xing)疾病(bing)(bing)，影(ying)響(xiang)全世界超過5%的(de)(de)65歲以(yi)上的(de)(de)人(ren)口(kou)。研究表明β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的(de)(de)積累可(ke)能在AD的(de)(de)形成過程中具有重(zhong)要作用(yong)。Aβ可(ke)能激活炎癥和毒害神(shen)經(jing)(jing)過程，導(dao)致(zhi)自由基的(de)(de)過剩，細(xi)胞內蛋白和其他大分子的(de)(de)氧化(hua)性(xing)損傷。D-半(ban)乳糖是晚期糖基化(hua)終末產物，誘導(dao)認知障礙，破壞突觸(chu)溝通(tong)。
本研究將巴戟(ji)天(tian)（M. officinalis，OMO）分(fen)別應(ying)用(yong)于(yu)D-半乳糖和(he)Aβ1-42誘導的AD-型癥狀的大鼠中，并檢(jian)測一系(xi)列指標(biao)(biao)，包括學習記憶能(neng)力，組織免疫(yi)學指標(biao)(biao)，細胞因子水平，腸道微生物菌群以及小腸和(he)大腦(nao)的轉錄(lu)表達(da)譜，并在(zai)過量抗(kang)生素(su)處理的三硝基苯(ben)磺(huang)酸（TNBS）誘導的小鼠模型中評估益生元的功(gong)效。
2 研究方法
測序(xu)技術：Illumina MiSeq + NextSeq 500
測序模式：微(wei)生物組(zu)16S rRNA基因V3-V4區測序+轉錄組(zu)測序
實驗設計：
1、D-半乳糖誘導的(de)缺陷大(da)鼠的(de)實驗設(she)計
2、Aβ1-42誘導的(de)缺陷大鼠的(de)實驗設(she)計
3、TNBS誘(you)導的IBD小(xiao)鼠中OMO益生元效應(ying)評估的實驗設計
3 研究結果
3.1 OMO對D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的作用效果
抗氧化和神經保護作用，激活能量代謝和調節乙酰膽堿酯酶
OMO的(de)(de)應用(yong)可以改善D-半乳(ru)(ru)糖誘導的(de)(de)大(da)鼠(shu)的(de)(de)學習能力和記(ji)憶功能障礙，也可以增強D-半乳(ru)(ru)糖誘導的(de)(de)缺陷大(da)鼠(shu)的(de)(de)抗氧化(hua)活性。OMO處理(li)組(zu)(zu)和模型(xing)組(zu)(zu)相比，小腸組(zu)(zu)織(zhi)的(de)(de)萎縮，變形和表面不均勻都有(you)所改善。尤其在OMO-100處理(li)組(zu)(zu)中，明(ming)顯減(jian)弱了(le)海馬體結(jie)構的(de)(de)分解以及CA1區神(shen)經(jing)元的(de)(de)丟失，說明(ming)OMO的(de)(de)應用(yong)改善了(le)D-半乳(ru)(ru)糖誘導的(de)(de)缺陷大(da)鼠(shu)。
圖1 OMO對D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的作用效果
OMO應用后腸道菌群的變化
D-半乳糖(tang)誘(you)導組(zu)的(de)(de)Chao1、ACE、Shannon和(he)npShanon等多樣性(xing)指(zhi)數顯著降低，Simpson指(zhi)數值(zhi)(zhi)則顯著增(zeng)大的(de)(de)（p<0.05）。尤其是在(zai)100 mg/kg/d的(de)(de)OMO處理后，Chao1、ACE、Shannon、npShanon和(he)Simpson的(de)(de)值(zhi)(zhi)都趨于和(he)正常組(zu)類似(si)的(de)(de)水平(ping)。結果表明，OMO應用可(ke)以維(wei)持D-半乳糖(tang)誘(you)導的(de)(de)缺陷(xian)大鼠的(de)(de)腸道菌群的(de)(de)多樣性(xing)水平(ping)。
圖2 OMO對D-半乳糖誘導的缺陷大鼠的腸道菌群的作用效果
3.2 OMO對Aβ1-42誘導的缺陷大鼠的作用效果
OMO應用后對參數指標的改良
OMO的(de)(de)應用可以(yi)(yi)(yi)改善Aβ1-42誘(you)(you)導的(de)(de)大鼠的(de)(de)學習和(he)記憶障礙(ai)。Aβ1-42誘(you)(you)導組(zu)經OMO處理(li)后細胞因子恢復到基(ji)線水平(ping)，說明OMO的(de)(de)應用可以(yi)(yi)(yi)顯(xian)著(zhu)改善炎(yan)癥水平(ping)，更可以(yi)(yi)(yi)促進一些單(dan)胺類神經遞質(zhi)的(de)(de)分泌。OMO處理(li)組(zu)可以(yi)(yi)(yi)改善Aβ1-42誘(you)(you)導組(zu)引起的(de)(de)萎縮(suo)，變形和(he)表(biao)面(mian)不規則等變化。模型組(zu)中的(de)(de)Aβ1-42和(he)Tau細胞所占比(bi)例明顯(xian)比(bi)正常組(zu)要高（p<0.05），同時OMO的(de)(de)應用下調了Tau蛋白的(de)(de)表(biao)達。
圖3 OMO對Aβ1-42誘導的缺陷大鼠的作用效果
OMO明顯改善了腸道菌群結構
OTU豐度(du)及其分(fen)(fen)類學組(zu)成(cheng)分(fen)(fen)析表明(ming)，Aβ1-42誘導(dao)組(zu)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)群落(luo)的多樣性(xing)降低，和Aβ1-42的劑量呈現負相關。OMO處理(li)組(zu)和Aβ1-42誘導(dao)組(zu)結果相反，減少了促炎微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)群，富集了抗炎微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)群，表明(ming)OMO的應用可以改(gai)善(shan)腸道菌(jun)(jun)(jun)群的結構。OMO處理(li)組(zu)中乳(ru)酸菌(jun)(jun)(jun)明(ming)顯(xian)增加，這說明(ming)OMO對AD動物(wu)(wu)的腸道菌(jun)(jun)(jun)群失(shi)調可能(neng)具有類似于益生(sheng)(sheng)元的有益作用。
圖4 OMO對Aβ1-42誘導的缺陷大鼠的腸道菌群的作用效果
3.3 OMO對TNBS誘導的IBD小鼠益生元效應研究
緩解TNBS結合抗生素引起的組織傷害和炎癥
TNBS處(chu)理組(zu)的小鼠表(biao)現(xian)出腹瀉，體重(zhong)增加趨勢下降。一些抗炎(yan)性細胞因(yin)子分泌(mi)呈現(xian)差異性，結腸組(zu)織(zhi)和(he)脾臟組(zu)織(zhi)遭到嚴(yan)重(zhong)損傷。免疫組(zu)織(zhi)化學染色結果(guo)表(biao)明(ming)Foxp3，IL-17，NF-kB，TNF-α偏(pian)離了正常水(shui)(shui)平(ping)，尤(you)其是(shi)抗生素過量(liang)處(chu)理組(zu)。OMO處(chu)理后，所有偏(pian)離的參數都回復到基準水(shui)(shui)平(ping)，尤(you)其是(shi)OMO+雙歧(qi)桿菌處(chu)理組(zu)。實(shi)驗結果(guo)表(biao)明(ming)，OMO和(he)雙歧(qi)桿菌在IBD小鼠中協同發(fa)揮抗炎(yan)作用。
圖5 OMO改善了高劑量抗生素和TNBS誘導的IBD小鼠的病理指標
提升雙歧桿菌的移植能力
TNBS和TNBS+抗生(sheng)素誘導組中，微生(sheng)物菌(jun)群的(de)多樣性(xing)呈現(xian)降低趨勢。而OMO可以改善(shan)這種菌(jun)群失(shi)調(diao)癥狀。雙(shuang)歧桿菌(jun)的(de)相對豐(feng)度明顯(xian)增加，其它益生(sheng)菌(jun)如(ru)乳桿菌(jun)類群在整體(ti)菌(jun)群中的(de)含量也較豐(feng)富。
圖7 OMO對高劑量抗生素和TNBS誘導的IBD大鼠的腸道菌群的作用效果
3.4 Aβ水平對菌群-腸-腦軸的影響
在CA1區(qu)注射(she)10/20 mg的Aβ1-42后，每(mei)周收集一次糞便樣本，連續收集4周，并(bing)通過16S rRNA基因測序進行(xing)微生物群(qun)落分(fen)析(xi)，同時檢測Aβ1-42注射(she)后第5周的小腸和腦組織的轉(zhuan)錄表(biao)達譜。
Aβ1-42誘導的缺陷大鼠中腸道菌群動態變化和KEGG通路注釋分析
大鼠(shu)腸道菌群(qun)的(de)(de)結構隨著Aβ1-42發生變(bian)化(hua)，揭示腦中Aβ1-42水平(ping)(ping)顯著影響(xiang)腸道菌群(qun)的(de)(de)組成。優勢(shi)物(wu)種的(de)(de)變(bian)化(hua)與乳酸桿菌科(ke)的(de)(de)豐度，是和Aβ1-42的(de)(de)劑量呈(cheng)現負相關的(de)(de)。KEGG分(fen)析結果表明，AD型(xing)嚙(nie)齒動物(wu)模型(xing)改變(bian)了(le)氨基(ji)酸代(dai)(dai)謝、外源性物(wu)質的(de)(de)生物(wu)降解、核苷酸代(dai)(dai)謝等通路，這(zhe)些代(dai)(dai)謝通路通過OMO的(de)(de)應用普(pu)遍(bian)得到(dao)改善。同時還發現，注射Aβ1-42后的(de)(de)第(di)5周(zhou)，海馬體中Aβ1-42的(de)(de)水平(ping)(ping)影響(xiang)了(le)腸道菌群(qun)的(de)(de)代(dai)(dai)謝。
圖8 Aβ1-42對大鼠腸道微生物群的作用效果
圖9腸道微生物代謝系統的KEGG通路富集分析
Aβ1-42注射后缺陷大鼠小腸和腦的轉錄組分析
小腸轉錄組分析
RNA-Seq測序(xu)分析發現，308個(ge)基(ji)因(yin)在(zai)(zai)Aβ1-42-10與對(dui)照組之間差(cha)異(yi)(yi)(yi)表(biao)達(da)(da)，1031個(ge)基(ji)因(yin)在(zai)(zai)Aβ1-42-20與對(dui)照組之間差(cha)異(yi)(yi)(yi)表(biao)達(da)(da)，1059個(ge)基(ji)因(yin)在(zai)(zai)Aβ1-42-10與Aβ1-42-20之間差(cha)異(yi)(yi)(yi)表(biao)達(da)(da)，表(biao)明小鼠腦(nao)的Aβ1-42水平(ping)影響了(le)小腸轉錄組水平(ping)。差(cha)異(yi)(yi)(yi)基(ji)因(yin)的GO富集(ji)(ji)分析結果說明腸道的炎癥(zheng)反應被激活，而腸道微生物(wu)變化可能影響了(le)腸道免疫和(he)炎癥(zheng)反應。KEGG富集(ji)(ji)分析結果說明腦(nao)中Aβ1-42水平(ping)可能影響了(le)腸道的功(gong)能。
圖10 小腸轉錄組分析
腦轉錄組分析
差(cha)異基因分(fen)析(xi)結(jie)(jie)果表(biao)明(ming)，Aβ1-42水(shui)平可以(yi)顯著影(ying)響腦轉錄組。GO富集分(fen)析(xi)結(jie)(jie)果顯示(shi)AD的(de)出現依賴于Aβ1-42的(de)積累。KEGG結(jie)(jie)果表(biao)明(ming)Aβ1-42水(shui)平會影(ying)響大腦的(de)功能(neng)。
顯著差異(yi)表達(da)(da)的(de)基因(yin)之(zhi)間(jian)的(de)互(hu)作(zuo)分(fen)析說明Aβ1-42水平(ping)(ping)引(yin)起了(le)互(hu)作(zuo)基因(yin)數(shu)量(liang)的(de)增加。KEGG富集(ji)分(fen)析顯示，Aβ-10注射組的(de)差異(yi)表達(da)(da)基因(yin)主(zhu)要富集(ji)于蛋白降(jiang)解(jie)、細胞凋亡和(he)血小(xiao)板激活。以上結(jie)果可能(neng)是因(yin)為結(jie)腸(chang)細菌無(wu)法正常工(gong)作(zuo)或者丟失所致，不易消化(hua)的(de)多肽和(he)蛋白不能(neng)發酵，短鏈脂肪酸如丁酸鹽(yan)、丙(bing)酸鹽(yan)和(he)醋酸鹽(yan)缺乏導致了(le)血小(xiao)板激活。隨著Aβ1-42水平(ping)(ping)的(de)增加，KEGG富集(ji)分(fen)析結(jie)果顯示，醛(quan)固酮合成和(he)分(fen)析、MAPK信號通路收到影響。結(jie)合腸(chang)道微(wei)(wei)生物(wu)群落多樣(yang)性(xing)和(he)腸(chang)道-腦轉(zhuan)錄組數(shu)據，發現海馬體中(zhong)Aβ1-42水平(ping)(ping)影響腸(chang)道微(wei)(wei)生物(wu)。
圖11 腦組織轉錄組分析
4 總結
本文研究(jiu)將OMO應(ying)用于(yu)AD病(bing)癥(zheng)的大鼠(shu)（D-半乳(ru)糖(tang)和Aβ1-42誘導的缺陷大鼠(shu)），驗(yan)證(zheng)OMO是(shi)否能通過靶向(xiang)腸(chang)道菌(jun)群-腸(chang)-腦(nao)(nao)軸有效緩(huan)解AD。研究(jiu)結(jie)果(guo)表明(ming)，傳統藥物巴(ba)戟天對各類神經疾病(bing)例如AD的作(zuo)用效果(guo)，可能是(shi)由于(yu)OMO的天然化學組分(fen)調整了腸(chang)道微(wei)生態和腦(nao)(nao)生理的相(xiang)互(hu)作(zuo)用。
本(ben)研究亮點：
1、研究巴戟天低聚果(guo)糖（OMO）對阿爾(er)茲海(hai)默癥(zheng)（AD）的作(zuo)用；
2、OMO處理可緩解AD大鼠模型(xing)的學習及記憶能力障(zhang)礙，改善氧化(hua)應激及炎癥疾病，調節神經遞質(zhi)的合成與分(fen)泌；
3、OMO可緩(huan)解腦組織腫脹、神(shen)經元(yuan)凋亡，并(bing)下調AD的胞內標記物（Tau蛋白及Aβ1-42）的表(biao)達；
4、OMO可維持腸道菌群的多樣性及穩(wen)定性；
5、另外，OMO還可調(diao)節抗生(sheng)素誘導的IBD小鼠模型的腸(chang)道菌群組(zu)成及代謝。
參考文獻
Chen D, Yang X, Yang J, et al. Prebiotic Effect of Fructooligosaccharides from Morinda officinalis on Alzheimer’s Disease in Rodent Models by Targeting the Microbiota-Gut-Brain Axis[J]. Frontiers in Aging Neuroscience, 2017, 09:403.
