2025-01-06
前(qian)言
染色體外(wai)(wai)環狀(zhuang)DNA（eccDNA）是一(yi)類游離(li)于(yu)染色體外(wai)(wai)的(de)環狀(zhuang)DNA，廣泛存在于(yu)包(bao)括(kuo)人類在內(nei)的(de)多(duo)種真(zhen)核生物(wu)中(zhong)，并參與基因(yin)(yin)表達調控(kong)、細胞增(zeng)殖、DNA損傷修復及腫瘤發生等多(duo)個(ge)生物(wu)學過程。由(you)于(yu)eccDNA不易被核酸(suan)酶降(jiang)解，且結構較為穩定，因(yin)(yin)此(ci)具有重要(yao)的(de)生物(wu)學功(gong)能。目前(qian)，研究eccDNA的(de)主(zhu)要(yao)方法(fa)(fa)包(bao)括(kuo)DNA熒光原位雜交（FISH）、批量全(quan)基因(yin)(yin)組測(ce)(ce)序(xu)（WGS）和(he)Circle-Seq。前(qian)兩種方法(fa)(fa)主(zhu)要(yao)用于(yu)檢測(ce)(ce)來(lai)源于(yu)相對較大基因(yin)(yin)組區域、豐度較高的(de)eccDNA，而Circle-Seq則能夠識別廣泛的(de)eccDNA，但需(xu)要(yao)較大數(shu)量的(de)細胞進行測(ce)(ce)序(xu)分析(xi)。因(yin)(yin)此(ci)，亟需(xu)開發一(yi)種通(tong)用且可擴(kuo)展的(de)方法(fa)(fa)，用以檢測(ce)(ce)從組織活檢中(zhong)提取的(de)單(dan)個(ge)細胞或細胞核中(zhong)的(de)eccDNA，從而揭示eccDNA的(de)生物(wu)學復雜性(xing)，并闡明其在患者來(lai)源腫瘤樣本中(zhong)的(de)異質性(xing)。
2024年2月，瑞典卡羅林斯卡醫學院的科研人員在Nature Communications雜志在線發表題為“scCircle-seq unveils the diversity and complexity of extrachromosomal circular DNAs in single cells”的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)論文。研(yan)究(jiu)團隊開發并驗(yan)證了Circle-seq的(de)(de)(de)(de)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)應(ying)用scCircle-seq，該方法(fa)適(shi)用于(yu)非固定(ding)和固定(ding)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)或細(xi)(xi)胞(bao)(bao)核，包括從腫瘤活檢(jian)組(zu)織中提取的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)核。研(yan)究(jiu)顯示(shi)，大多數eccDNA在同一(yi)類型的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)之間表現(xian)出高(gao)度的(de)(de)(de)(de)可變(bian)性(xing)(xing)(xing)，且傾向于(yu)在基(ji)因組(zu)擴增區域形成。此外(wai)，將scCircle-seq應(ying)用于(yu)三種不(bu)同癌癥類型的(de)(de)(de)(de)腫瘤樣本中，研(yan)究(jiu)人員發現(xian)了腫瘤特異性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)eccDNA圖譜(pu)，并揭示(shi)了具有不(bu)同eccDNA基(ji)因組(zu)模式的(de)(de)(de)(de)亞克隆(long)群(qun)體(ti)。綜上(shang)所述，scCircle-seq作為一(yi)種易于(yu)擴展(zhan)、直接(jie)且通用的(de)(de)(de)(de)方法(fa)，具有揭示(shi)癌癥中eccDNA生(sheng)物學復雜性(xing)(xing)(xing)和異質性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)潛(qian)力。
01、技術原理
為(wei)了(le)開發(fa)scCircle-seq，研究(jiu)團(tuan)隊在(zai)Circle-Seq流(liu)程的(de)基(ji)(ji)礎上引入了(le)一(yi)(yi)個(ge)額外的(de)DNA缺口(kou)修復步驟，以(yi)提高eccDNA的(de)檢(jian)測(ce)效率，并設計了(le)一(yi)(yi)個(ge)通(tong)用(yong)(yong)的(de)工作流(liu)程，適用(yong)(yong)于通(tong)過多孔板或單(dan)管分選的(de)活(huo)細胞、固定細胞以(yi)及細胞核(he)。為(wei)了(le)解析scCircle-seq數(shu)據，研究(jiu)團(tuan)隊改編了(le)先(xian)前用(yong)(yong)于分析大規模Circle-Seq數(shu)據的(de)生(sheng)(sheng)物信息學流(liu)程：該流(liu)程首先(xian)識別具有高測(ce)序(xu)覆蓋度(du)的(de)基(ji)(ji)因組區(qu)域(yu)（即產(chan)生(sheng)(sheng)eccDNA的(de)基(ji)(ji)因組區(qu)域(yu)，CPRs），然(ran)后通(tong)過搜索映射在(zai)CPR內的(de)過度(du)表(biao)示的(de)非一(yi)(yi)致(zhi)性和分裂reads對，確定每個(ge)CPR內的(de)嵌合連(lian)接。此外，研究(jiu)團(tuan)隊還驗(yan)證了(le)scCircle-seq的(de)特異(yi)性，結(jie)果與預期(qi)一(yi)(yi)致(zhi)。
為了進一步(bu)驗(yan)證該方法，研究團隊將scCircle-seq應用于(yu)5個(ge)不同的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)，包(bao)括4個(ge)癌(ai)癥衍(yan)生細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)（HeLa、K562、Colo320DM和PC3）和1個(ge)永生化正(zheng)常(chang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)（293T）。結果(guo)表(biao)明(ming)，鑒定出的(de)(de)(de)CPRs數量(liang)及其對應的(de)(de)(de)基因組覆蓋率(lv)在單個(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系(xi)之間存在顯著差異，這與已發表(biao)的(de)(de)(de)Circle-Seq數據一致(zhi)，表(biao)明(ming)大多數eccDNA在細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)間表(biao)現出顯著的(de)(de)(de)差異，并(bing)且在細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分裂過(guo)程中是(shi)以(yi)隨(sui)機方式遺傳的(de)(de)(de)。
圖1 scCircle-seq工作(zuo)流程及數據驗證
02、研究(jiu)內(nei)容
1、單細胞中eccDNA的基因組圖譜
研(yan)究團(tuan)隊(dui)分(fen)析了scCircle-seq檢測(ce)到的(de)(de)eccDNA的(de)(de)基因(yin)組分(fen)布，以確定是否存在特定的(de)(de)模式。結果(guo)發(fa)現，eccDNA在單細(xi)胞水平(ping)上表現出極大(da)的(de)(de)變異性(xing)(xing)(xing)，但(dan)在群(qun)體水平(ping)上可能呈現出更明確的(de)(de)分(fen)布模式。根(gen)據同一細(xi)胞系中所(suo)有單細(xi)胞中對應(ying)CPR的(de)(de)頻(pin)率及其均勻(yun)性(xing)(xing)(xing)評分(fen)，研(yan)究團(tuan)隊(dui)將scCircle-seq鑒定出的(de)(de)eccDNA分(fen)為(wei)四組進(jin)行(xing)驗證（見圖2）。結果(guo)顯示，絕大(da)多數檢測(ce)到的(de)(de)eccDNA（88-99%）被歸類為(wei)低頻(pin)低均勻(yun)性(xing)(xing)(xing)（LFLU），少數則(ze)歸類為(wei)高頻(pin)高均勻(yun)性(xing)(xing)(xing)（HFHU），主要存在于Colo320DM和293T細(xi)胞中。上述結果(guo)表明，eccDNA本質上具有高度的(de)(de)異質性(xing)(xing)(xing)，但(dan)scCircle-seq能夠有效(xiao)區分(fen)不同類型的(de)(de)eccDNA。
進一步(bu)的分(fen)(fen)析(xi)將鑒(jian)定出的CPRs與(yu)各種(zhong)基(ji)因(yin)組注釋數據進行交(jiao)集(ji)，探索了scCircle-seq檢測到的eccDNA在基(ji)因(yin)組中的分(fen)(fen)布(bu)。結果(guo)發現，CPRs在組蛋白(bai)H3K9me3（構成(cheng)性(xing)異(yi)染(ran)色(se)質(zhi)(zhi)）和(he)H3K27me3（選擇性(xing)異(yi)染(ran)色(se)質(zhi)(zhi)）標記的染(ran)色(se)質(zhi)(zhi)區域(yu)中富集(ji)，表明eccDNA的形成(cheng)主(zhu)要集(ji)中在異(yi)染(ran)色(se)質(zhi)(zhi)區域(yu)。
圖2 scCircle-seq揭示了(le)單細胞(bao)中染(ran)色體外(wai)環狀DNA的多樣性(xing)和(he)復雜(za)性(xing)
2、基于eccDNA的(de)細胞類(lei)型分類(lei)
進一(yi)步，研究團隊(dui)探討了細(xi)胞(bao)中的(de)eccDNA序列是(shi)否呈隨(sui)機分(fen)(fen)布，或者是(shi)否能(neng)夠(gou)利用scCircle-seq識別(bie)不同細(xi)胞(bao)類型的(de)eccDNA特征（見(jian)圖3）。首先，研究團隊(dui)將(jiang)scCircle-seq檢(jian)測(ce)到(dao)的(de)CPRs基因組(zu)分(fen)(fen)布表(biao)示為一(yi)個“cells × bins”矩陣，其中“cells”表(biao)示通過scCircle-seq分(fen)(fen)析(xi)的(de)單個細(xi)胞(bao)數量，“bins”則(ze)是(shi)定義好的(de)長度的(de)連續基因組(zu)窗口。接著，團隊(dui)使用cisTopic計算框架對細(xi)胞(bao)進行(xing)聚類，并根據(ju)可用的(de)基因組(zu)軌跡對每個聚類進行(xing)注釋(shi)。
結果顯示(shi)，該(gai)方法能(neng)夠成功地將(jiang)同(tong)(tong)(tong)一細胞類(lei)型(xing)的(de)細胞聚(ju)類(lei)在(zai)一起。進一步分析表明，盡管相(xiang)同(tong)(tong)(tong)類(lei)型(xing)細胞之(zhi)間的(de)eccDNA數量和來源區域存在(zai)較大差(cha)異，不同(tong)(tong)(tong)細胞類(lei)型(xing)仍然表現出一定(ding)的(de)特(te)(te)定(ding)eccDNA特(te)(te)征(zheng)，這些特(te)(te)征(zheng)部分反映了(le)各自的(de)表觀基因組特(te)(te)征(zheng)。
圖3 eccDNA的細胞(bao)特異(yi)性和(he)動力學
3、scCircle-seq應(ying)用于患者來源腫瘤樣本
研(yan)究團隊(dui)將scCircle-seq應用(yong)于從(cong)三(san)種回顧性收(shou)集的(de)冷凍(dong)腫(zhong)瘤(liu)樣本(ben)中(zhong)提(ti)取的(de)細(xi)胞核（分別為1例(li)前列腺腺癌PRAD、1例(li)三(san)陰性乳腺癌TNBC和1例(li)管(guan)腔B型乳腺癌LumB），驗證了(le)(le)scCircle-seq在患者(zhe)來(lai)源(yuan)腫(zhong)瘤(liu)樣本(ben)中(zhong)的(de)適(shi)用(yong)性。最終，研(yan)究團隊(dui)獲(huo)得了(le)(le)55個(ge)PRAD細(xi)胞核、87個(ge)TNBC細(xi)胞核和33個(ge)LumB細(xi)胞核的(de)高質(zhi)量測(ce)序(xu)數據(ju)，所有(you)細(xi)胞中(zhong)的(de)環形DNA與線性DNA的(de)比值(zhi)接近100%，這一結(jie)果(guo)與從(cong)永生(sheng)化細(xi)胞系(xi)中(zhong)獲(huo)得的(de)結(jie)果(guo)一致，表明即使在腫(zhong)瘤(liu)活檢中(zhong)提(ti)取的(de)細(xi)胞核，scCircle-seq仍能穩定(ding)有(you)效地工作。
結果顯示，PRAD細胞(bao)(bao)中的(de)(de)CPRs數量最(zui)多，且覆蓋(gai)的(de)(de)基(ji)因組區域比例最(zui)高，其次(ci)是TNBC和LumB細胞(bao)(bao)，表(biao)明(ming)(ming)這些腫瘤(liu)細胞(bao)(bao)具有不同的(de)(de)eccDNA圖譜。此外，研(yan)究團隊對單(dan)細胞(bao)(bao)CPRs的(de)(de)基(ji)因組圖譜進行了UMAP降維分(fen)析(xi)和差(cha)異主題分(fen)析(xi)，發(fa)現PRAD與(yu)TNBC、LumB細胞(bao)(bao)形(xing)成(cheng)了兩個(ge)明(ming)(ming)顯不同的(de)(de)簇，表(biao)明(ming)(ming)這兩類腫瘤(liu)攜帶不同的(de)(de)eccDNA基(ji)因組特征，這與(yu)它們各自的(de)(de)起源組織一(yi)致。
進一(yi)步，研究(jiu)團(tuan)隊(dui)(dui)將LumB和TNBC細(xi)(xi)胞(bao)中鑒(jian)定(ding)(ding)的CPRs與癌癥基(ji)(ji)因(yin)組(zu)圖譜（TCGA）數據庫(ku)中乳腺(xian)癌樣本的體細(xi)(xi)胞(bao)拷貝(bei)數變化(hua)（SCNAs）數據進行了交叉分析(xi)。結(jie)果(guo)顯(xian)示(shi)，相(xiang)(xiang)較于TNBC簇2細(xi)(xi)胞(bao)的CPRs，TNBC簇1和LumB細(xi)(xi)胞(bao)的CPRs在(zai)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)區域中顯(xian)著富集。研究(jiu)團(tuan)隊(dui)(dui)還分析(xi)了鑒(jian)定(ding)(ding)的eccDNA數量(liang)與相(xiang)(xiang)應(ying)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)區域拷貝(bei)數之間(jian)的關系(xi)，發(fa)現CPRs的數量(liang)在(zai)二(er)倍體和中度擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)區域之間(jian)無(wu)顯(xian)著差異，而在(zai)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)水平較高(gao)的區域則明顯(xian)增(zeng)(zeng)多。上述結(jie)果(guo)表明，腫(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)的eccDNA分布反(fan)映了其SCNA特征，高(gao)度擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)的基(ji)(ji)因(yin)組(zu)區域更(geng)容易產生更(geng)多的eccDNA。
圖4 scCircle-seq揭示了單細胞(bao)中(zhong)染(ran)色體外(wai)環狀DNA的多(duo)樣性和復雜性
03、總結
綜上(shang)所述，研(yan)究團隊開發(fa)了scCircle-seq方法，能(neng)(neng)夠在單(dan)細胞水平上(shang)深入分析eccDNA的(de)(de)(de)多樣性和復雜(za)性。scCircle-seq結合了滾環擴(kuo)(kuo)增（RCA）和DNA缺口修復步驟，顯(xian)著提高了檢測靈敏度(du)，不僅能(neng)(neng)夠識(shi)別富集的(de)(de)(de)、含有癌(ai)基因的(de)(de)(de)eccDNA，還能(neng)(neng)檢測到罕(han)見的(de)(de)(de)eccDNA。特別地，scCircle-seq簡化了工作(zuo)流(liu)程(cheng)，降低了低豐度(du)eccDNA丟失的(de)(de)(de)風險。總體(ti)而言，scCircle-seq是(shi)一(yi)種(zhong)可擴(kuo)(kuo)展的(de)(de)(de)工具(ju)，適用于分析不同細胞和組織類型中(zhong)的(de)(de)(de)eccDNA復雜(za)性，并有望進一(yi)步推動eccDNA在癌(ai)癥診斷中(zhong)的(de)(de)(de)應(ying)用潛力(li)。
