一、微生物多樣性常(chang)見問(wen)題(ti)

1.微生(sheng)物組常用(yong)的(de)產品(pin)有哪些(xie)？

答：微生物組(zu)常用的產品包括微生物多(duo)樣性，宏基因(yin)組(zu)和宏轉錄組(zu)等(deng)。

微生物多樣性也叫(jiao)擴(kuo)(kuo)增(zeng)子(zi)測(ce)序，是一(yi)種廣(guang)泛應用于環境(jing)微生物(wu)群(qun)落(luo)結構研(yan)究的(de)(de)技術。它主要(yao)通過PCR（聚(ju)合(he)酶鏈反應）技術對(dui)特定的(de)(de)基因(yin)片段進(jin)行擴(kuo)(kuo)增(zeng)，然(ran)后通過對(dui)這些擴(kuo)(kuo)增(zeng)產物(wu)進(jin)行高通量測(ce)序來分(fen)析樣品中(zhong)微生物(wu)群(qun)落(luo)的(de)(de)組成和多樣性。

宏基因組（Metagenome）和宏(hong)轉錄組（Metatranscriptome）是通過鳥槍法測(ce)序技術（Shotgun sequencing），結合全微生物組關聯(lian)分析（Microbiome-Wide Association Studies，MWAS）的(de)(de)策略，分別從DNA/RNA水(shui)平，全(quan)面精細地(di)展示整個微(wei)生物(wu)群落(luo)的(de)(de)物(wu)種組(zu)成譜(pu)、功能代謝譜(pu)、表達譜(pu)，進而從原理上闡明微(wei)生物(wu)群落(luo)在(zai)生態系(xi)統中發揮作(zuo)用(yong)的(de)(de)根本機制。

多樣性(xing)組(zu)成(cheng)譜(pu)測序主要(yao)研究微(wei)生物(wu)群落的物(wu)種(zhong)組成、物(wu)種(zhong)間的進化關系以及(ji)群落的多樣性。

宏基因組/宏轉(zhuan)錄組測序是(shi)對(dui)群落中所有微生物的(de)基(ji)因(yin)序列或(huo)其對(dui)應的(de)轉錄(lu)本進行研究，因(yin)此，不僅可以(yi)獲得編碼這些基(ji)因(yin)的(de)物種(zhong)信息(可以(yi)深(shen)入到種(zhong)甚(shen)至菌株水平(ping))還(huan)可以(yi)對(dui)測到的(de)眾多基(ji)因(yin)進行功能層(ceng)面的(de)更廣泛(fan)的(de)研究。

因(yin)(yin)(yin)此，多樣(yang)性(xing)(xing)組(zu)(zu)(zu)(zu)成譜關注微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)物(wu)種(zhong)(zhong)多樣(yang)性(xing)(xing)、組(zu)(zu)(zu)(zu)成和它(ta)們的(de)(de)(de)豐度分布，宏(hong)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)除了(le)可(ke)以(yi)得到微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)群(qun)(qun)(qun)落(luo)的(de)(de)(de)物(wu)種(zhong)(zhong)組(zu)(zu)(zu)(zu)成的(de)(de)(de)精細信(xin)息外，還可(ke)以(yi)了(le)解群(qun)(qun)(qun)落(luo)中微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)所攜帶的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)功(gong)能(neng)特性(xing)(xing),及(ji)其(qi)所涉及(ji)的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)通(tong)路,而宏(hong)轉錄組(zu)(zu)(zu)(zu)則可(ke)以(yi)看(kan)作(zuo)是(shi)宏(hong)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)(de)(de)活性(xing)(xing)表(biao)達的(de)(de)(de)“子集”，是(shi)對群(qun)(qun)(qun)落(luo)中具有活性(xing)(xing)的(de)(de)(de)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)、及(ji)其(qi)正在表(biao)達轉錄的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)功(gong)能(neng)進行研(yan)究。簡(jian)而言(yan)之，多樣(yang)性(xing)(xing)組(zu)(zu)(zu)(zu)成譜測序(xu)(xu)(xu)能(neng)夠告訴(su)我們“誰在其(qi)中”，宏(hong)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)測序(xu)(xu)(xu)則能(neng)展現群(qun)(qun)(qun)落(luo)中各微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)成員的(de)(de)(de)“分工職責”，而宏(hong)轉錄組(zu)(zu)(zu)(zu)測序(xu)(xu)(xu)將揭示這些(xie)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)“正在做哪(na)些(xie)事情”

2. 菌群多樣性(xing)組成譜測序，該如何(he)選擇 rRNA 基因的可變區(qu) (V區(qu))?

答：1)對于原核(he)微生物群落(細菌(jun)或古菌(jun))而言，16SrRNA基因的(de)9個(ge)可(ke)變區(qu)(qu)(qu)從理(li)論(lun)上來說都是可(ke)以選擇(ze)的(de)，但(dan)根據(ju)我們大量的(de)實驗以及發表(biao)文獻(xian)統計結(jie)(jie)果，結(jie)(jie)合各V區(qu)(qu)(qu)的(de)長度，目(mu)前，二代Illumina 測序(xu)中應(ying)用比較多的(de)單V區(qu)(qu)(qu)是V4區(qu)(qu)(qu)(~250bp)，雙V區(qu)(qu)(qu)是V3-V4區(qu)(qu)(qu)(~470bp)或V4-V5區(qu)(qu)(qu)(~420bp)。另外，如果是對 16S rRNA 基因進(jin)行三代 PacBio 測序(xu)，則能夠覆蓋整(zheng)個(ge) 16S rRNA 基因全長(大約1.6 kb);

2)對于(yu)真菌菌群(qun)而言(yan)，相比(bi)18S rRNA 基(ji)因(yin)，ITS序列的(de)進化(hua)速率(lv)更快，能夠累積更多的(de)物(wu)種變異，因(yin)此對于(yu)真菌物(wu)種檢測的(de)分辨(bian)率(lv)更高。目前，二代(dai)Illumina 測序中(zhong)應用最多的(de)是ITSI區(qu)，ITS2 區(qu)次之，而三代(dai) PacBio 測序則可以(yi)覆蓋ITS 全長，即ITS1 區(qu) +5.8S rRNA 基(ji)因(yin) +ITS2 區(qu);

3)除真菌(jun)外，對于(yu)其它真核(he)微生物而(er)言，二代 Illumina測(ce)序(xu)中應用最多的(de)是(shi) 18SrRNA 基因的(de) V4 區(qu)，而(er)三代 PacBio 測(ce)序(xu)則可以覆蓋 18S rRNA 基因的(de)近全長。

擴增(zeng)子實驗(yan)流程以(yi)及擴增(zeng)區域選擇

3.微(wei)生(sheng)物(wu)多樣性(xing)同批次測序的各個(ge)樣本,測序得到的序列數(shu)有(you)差異,對數(shu)據分(fen)析會有(you)影響嗎?

答：同批次(ci)測(ce)序(xu)的各個樣本(ben)(ben)，測(ce)序(xu)得到(dao)的序(xu)列(lie)數(shu)不可能一(yi)模一(yi)樣，總會存在一(yi)定程度的波動,這是正常現象。序(xu)列(lie)數(shu)的差異與初始樣本(ben)(ben)量以(yi)及文庫(ku)定量等環(huan)節都有(you)一(yi)定關系。一(yi)般來講，由于這些樣品(pin)是一(yi)起建(jian)庫(ku)測(ce)序(xu)的，序(xu)列(lie)數(shu)的變(bian)化范圍(wei)比較(jiao)有(you)限。另外(wai)，我們(men)在分析(xi)過程中，會對每個樣本(ben)(ben)測(ce)到(dao)的序(xu)列(lie)數(shu)進行抽平處理，從而消(xiao)除由于測(ce)序(xu)量的差異導致的菌(jun)群組成結(jie)構上(shang)的不一(yi)致。

4.對于(yu)(yu)多樣(yang)性組成(cheng)譜測序、有哪(na)些(xie)常用物種注釋數據庫?各有哪(na)些(xie)特點?適用于(yu)(yu)哪(na)些(xie)微生(sheng)物類群?

答:常(chang)用的物種注釋數據(ju)庫包括 Greengenes、SILVA、NCBI、UNITE、RDP、Greengenes2等(deng)數據(ju)庫。

1)Greengenes 數據(ju)(ju)庫 13.8版本(ben)收錄了1,262,986條16S rRNA序列，是專門針對細菌、古菌 16S rRNA 基(ji)因的數據(ju)(ju)庫。該數據(ju)(ju)庫注釋偏向(xiang)于樣(yang)本(ben)為人源、腸道類樣(yang)本(ben),注釋效果較好，物(wu)種命名也比較規范，只是數據(ju)(ju)庫版本(ben)比較老，2013年(nian)8月(yue)之后(hou)沒再更新過;

2)SILVA 數據(ju)(ju)庫包含(han)細菌、古菌和真核生(sheng)物的(de)分類學信(xin)息。原核生(sheng)物的(de) 16S 和真核生(sheng)物 18S rRNA 基因都(dou)可以用(yong)該數據(ju)(ju)庫注(zhu)(zhu)釋分析。該數據(ju)(ju)庫注(zhu)(zhu)釋偏向于環境(jing)方面的(de)樣(yang)本，如土壤、水體、空氣等樣(yang)本，當(dang)然如人(ren)源與(yu)腸道(dao)方面的(de)樣(yang)本也(ye)可用(yong)該數據(ju)(ju)庫注(zhu)(zhu)釋,用(yong)途比較(jiao)廣泛。但是，該數據(ju)(ju)庫的(de)物種命名，不如Greengenes 規范;

3)NCBI數(shu)據庫包含(han)提交NCBI序列數(shu)據庫相關的所(suo)有生物體(ti)的名稱，并(bing)且每日(ri)更新。可(ke)用于(yu)細菌(jun)、古菌(jun)、真菌(jun)和病(bing)毒序列的注釋(shi)分析，一般(ban)用于(yu)功能基(ji)因方面(mian)的注釋(shi)及真核(he) 18S rRNA 基(ji)因數(shu)據注釋(shi);

4)UNITE 數(shu)據庫包含的是高(gao)質(zhi)量 ITS參考(kao)序列(lie)(lie)，是專門針對(dui)真菌(jun)ITS序列(lie)(lie)的數(shu)據庫;

5)RDP數據(ju)庫基(ji)于來自細菌(jun)、古菌(jun)和(he)真(zhen)菌(jun)的(de)(de)rRNA 基(ji)因序列。可用(yong)于細菌(jun)和(he)古菌(jun)16S rRNA 基(ji)因和(he)真(zhen)菌(jun) 28S rRNA 基(ji)因的(de)(de)注釋分析，物種命名(ming)比(bi)較(jiao)規范，但 RDP 數據(ju)庫注釋只能到屬(shu)水平(ping)，且 2016年(nian)9月(yue)30日之后就沒(mei)再(zai)更新(xin)過。

此外，對于某些特定的(de)微生物類群(qun)，我們也能選擇針(zhen)對性的(de)數據(ju)(ju)庫進行物種(zhong)注(zhu)釋。比如(ru)，MaarjAM 數據(ju)(ju)庫可(ke)(ke)用于 AMF 叢枝(zhi)菌(jun)根真菌(jun)群(qun)落(luo)的(de)注(zhu)釋，HOMD 數據(ju)(ju)庫可(ke)(ke)用于人體口腔菌(jun)群(qun)的(de)注(zhu)釋，PR2 可(ke)(ke)用于原生生物群(qun)落(luo)的(de)注(zhu)釋。

6）Greengenes2 數據(ju)庫(ku)(ku)(ku)：2023年7月，Nature Biotechnology（IF: 46.9）發(fa)表(biao)了Daniel McDonald（通訊作(zuo)者(zhe)Rob Knight）等人的文章，引入(ru)了Greengenes2。這是(shi)(shi)一個參考樹，通過將序列插入(ru)到全基因(yin)組(zu)系(xi)統(tong)發(fa)育(yu)樹中(zhong)，將基因(yin)組(zu)和16S rRNA數據(ju)庫(ku)(ku)(ku)統(tong)一在一個一致的、集成的資源中(zhong)。結果表(biao)明從相同的樣(yang)本(ben)中(zhong)生成的16S rRNA和宏基因(yin)組(zu)數據(ju)在主坐(zuo)標空(kong)間、分類(lei)學和表(biao)型效應大小上是(shi)(shi)一致的。此外(wai)，Greengenes2數據(ju)庫(ku)(ku)(ku)的系(xi)統(tong)發(fa)育(yu)覆蓋(gai)率(lv)遠大于SILVA、Greengenes和GTDB等數據(ju)庫(ku)(ku)(ku)。Greengenes2數據(ju)庫(ku)(ku)(ku)將會是(shi)(shi)微生物組(zu)研究的一個利器(qi)。

微(wei)生(sheng)物多樣性物種注釋數據(ju)庫

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擴增(zeng)子和宏基因(yin)組(zu)測序常(chang)用數據(ju)庫(ku)介紹

5.多樣(yang)性組成譜測(ce)序，可以鑒定到種嗎?

答：在(zai)以16S/18S rRNA基(ji)因(yin)或(huo)ITS區域為目標序(xu)列的(de)菌群多樣性組成譜(pu)測(ce)序(xu)研究中(zhong)，Illumina等(deng)二(er)代測(ce)序(xu)平(ping)(ping)臺一(yi)般只能對單個或(huo)連續的(de)兩三個可變區序(xu)列進(jin)行測(ce)序(xu)分析,通(tong)常情(qing)況下無(wu)法(fa)獲得(de)(de) rRNA 基(ji)因(yin)全(quan)長序(xu)列的(de)信息，因(yin)而往(wang)(wang)往(wang)(wang)只能在(zai)屬(shu)水平(ping)(ping)進(jin)行物種(zhong)(zhong)(zhong)鑒定分析，而難(nan)以在(zai)種(zhong)(zhong)(zhong)等(deng)精(jing)細水平(ping)(ping)識(shi)別測(ce)得(de)(de)的(de)序(xu)列，難(nan)以獲取“高分辨率”的(de)微生物物種(zhong)(zhong)(zhong)信息,菌群中(zhong)大量成員對應(ying)的(de)物種(zhong)(zhong)(zhong)信息仍處于“模糊”狀(zhuang)態。

而以 PacBio 公司(si)的(de) Sequel測(ce)(ce)序(xu)(xu)系統為代(dai)表的(de)三(san)代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)技(ji)術，利用專利的(de) SMRT單分子(zi)實(shi)時測(ce)(ce)序(xu)(xu)技(ji)術，可以對DNA序(xu)(xu)列實(shi)現單分子(zi)級別的(de)超長(chang)(chang)讀長(chang)(chang)測(ce)(ce)序(xu)(xu)，因而能夠輕易讀取微生物的(de) rRNA 基(ji)因全長(chang)(chang)序(xu)(xu)列;其次(ci)(ci)，通過(guo)PacBio所獨(du)有的(de)環形一致性測(ce)(ce)序(xu)(xu)模(mo)式(Circular-consensus sequence，CCs)，可以極大地提高(gao)單基(ji)測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)準確(que)(que)率(lv)，般而言(yan)，將 rRNA 基(ji)因全長(chang)(chang)序(xu)(xu)列循(xun)環測(ce)(ce)序(xu)(xu)5~6次(ci)(ci)后，獲得(de)的(de)一致性序(xu)(xu)列的(de)準確(que)(que)率(lv)可以達到 99.99%(QV40)以上(shang)，遠(yuan)遠(yuan)超過(guo)了二代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)準確(que)(que)率(lv)，從而充分保障獲得(de)的(de)rRNA基(ji)因全長(chang)(chang)序(xu)(xu)列的(de)精確(que)(que)性。

因(yin)此，在(zai)(zai)相同測(ce)序(xu)(xu)深度(du)下，PacBio的(de)(de)rRNA基因(yin)全長測(ce)序(xu)(xu)在(zai)(zai)種水平(ping)的(de)(de)分辨(bian)能(neng)力大大超過(guo)了 Illumina 的(de)(de)短片段測(ce)序(xu)(xu)，使菌群組成得(de)到(dao)精準解析(xi);不僅如此，由于(yu)讀長較短Illumina 會產(chan)生“無法確定歸(gui)屬(Unclassifed)”的(de)(de)物種，但這些物種的(de)(de)分類學信息都能(neng)通過(guo) PacBio 全長測(ce)序(xu)(xu)得(de)到(dao)準確識別。因(yin)此，PacBio 的(de)(de)SMRT 測(ce)序(xu)(xu)技術能(neng)夠大大提(ti)高(gao)我們在(zai)(zai)種水平(ping)解析(xi)菌群精細組成結構的(de)(de)能(neng)力。

當然，這也并非意味(wei)著Illumina測(ce)序(xu)(xu)技術不(bu)適合多樣性(xing)組成譜測(ce)序(xu)(xu)，只(zhi)是(shi)無法(fa)(fa)在種(zhong)等精細(xi)水(shui)平(ping)，獲得物種(zhong)組成的(de)(de)(de)全(quan)面信息。因(yin)此，如(ru)果進(jin)行(xing)Illumina 測(ce)序(xu)(xu)，我(wo)們建議是(shi)在屬水(shui)平(ping)進(jin)行(xing)相應分析，但如(ru)果有特殊需求，需要在種(zhong)水(shui)平(ping)進(jin)行(xing)分析，我(wo)們也可以開展，只(zhi)是(shi)可能(neng)會出(chu)現大部分物種(zhong)無法(fa)(fa)注釋到種(zhong)水(shui)平(ping)的(de)(de)(de)情況(也比較(jiao)容易引起審稿(gao)人質疑，因(yin)為片段(duan)較(jiao)短(duan));而(er)如(ru)果是(shi)進(jin)行(xing) PacBio 測(ce)序(xu)(xu)，我(wo)們默認(ren)都可進(jin)行(xing)種(zhong)水(shui)平(ping)的(de)(de)(de)分析。

三代(dai)微(wei)生物多樣性

6.多樣(yang)性(xing)組(zu)成(cheng)譜測(ce)序能(neng)分析功(gong)能(neng)基因(yin)嗎?功(gong)能(neng)基因(yin)測(ce)序和多樣(yang)性(xing)組(zu)成(cheng)譜測(ce)序，有(you)什么差別?

答：多樣性組成(cheng)譜測(ce)(ce)序主要是基(ji)(ji)于rRNA 基(ji)(ji)因的可變區(qu)(如16SrRNA 基(ji)(ji)因某V區(qu)或真(zhen)菌 rRNA 基(ji)(ji)因的 ITS 區(qu)域)進行(xing)(xing)環境微(wei)生物(wu)群(qun)落的多樣性和(he)組成(cheng)豐度的鑒定，因此并不是直(zhi)接基(ji)(ji)于某個功能基(ji)(ji)因的片段進行(xing)(xing)的測(ce)(ce)序和(he)分析(xi)。但是我(wo)們(men)有一項特色分析(xi)內容“菌群(qun)代(dai)謝功能預測(ce)(ce)”，可以根(gen)據測(ce)(ce)到(dao)的物(wu)種，推斷它(ta)們(men)可能具備(bei)的功能特性。

不(bu)過，如(ru)果老師(shi)(shi)關(guan)注(zhu)的(de)是某一(yi)個(ge)(ge)功能基(ji)(ji)因(yin)的(de)研究，我們建議您可(ke)以(yi)(yi)直接對這一(yi)功能基(ji)(ji)因(yin)開展(zhan)測(ce)(ce)(ce)序，而不(bu)需要測(ce)(ce)(ce)定rRNA 基(ji)(ji)因(yin)的(de)多樣性(xing)組(zu)成(cheng)譜，因(yin)為rRNA 基(ji)(ji)因(yin)測(ce)(ce)(ce)序獲得的(de)是廣譜的(de)微(wei)(wei)生物(wu)類群，而功能基(ji)(ji)因(yin)測(ce)(ce)(ce)序則(ze)可(ke)以(yi)(yi)避(bi)免測(ce)(ce)(ce)出與關(guan)注(zhu)功能不(bu)相(xiang)關(guan)的(de)微(wei)(wei)生物(wu)物(wu)種。另外(wai)，如(ru)果老師(shi)(shi)同時關(guan)注(zhu)整個(ge)(ge)群落(luo)中(zhong)的(de)多個(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)，我們建議您可(ke)以(yi)(yi)考(kao)慮(lv)采用(yong)宏基(ji)(ji)因(yin)組(zu)或(huo)者宏轉(zhuan)錄(lu)組(zu)測(ce)(ce)(ce)序，這樣可(ke)以(yi)(yi)獲得更(geng)為全面的(de)微(wei)(wei)生物(wu)編碼(ma)的(de)功能信息。

功(gong)能(neng)(neng)(neng)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)測(ce)(ce)(ce)序(xu)是擴增某(mou)一功(gong)能(neng)(neng)(neng)的(de)(de)(de)標志性基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)序(xu)列，解析具(ju)有這一功(gong)能(neng)(neng)(neng)的(de)(de)(de)微(wei)生物組(zu)(zu)成譜(pu)，需要(yao)用相(xiang)應的(de)(de)(de)特(te)定(ding)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)引物進(jin)行該(gai)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)PCR擴增，然后進(jin)行測(ce)(ce)(ce)序(xu)，反映的(de)(de)(de)是該(gai)特(te)定(ding)功(gong)能(neng)(neng)(neng)類(lei)群(qun)微(wei)生物的(de)(de)(de)組(zu)(zu)成結(jie)構，一般采(cai)用NCBI數據庫對功(gong)能(neng)(neng)(neng)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)測(ce)(ce)(ce)序(xu)數據進(jin)行物種(zhong)(zhong)注釋，常見(jian)的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)(neng)(neng)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)包括氮(dan)代(dai)謝的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，比如amoA、nirS、nirK、nxrA 等,以及碳代(dai)謝和磷(lin)代(dai)謝相(xiang)關(guan)(guan)的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)(neng)(neng)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin);而多樣性組(zu)(zu)成譜(pu)測(ce)(ce)(ce)序(xu)多是細菌(jun)/古(gu)菌(jun)16SrRNA基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)/真(zhen)菌(jun) ITS 內(nei)轉錄間隔區進(jin)行測(ce)(ce)(ce)序(xu)，反映的(de)(de)(de)是細菌(jun)/古(gu)菌(jun)或真(zhen)菌(jun)的(de)(de)(de)廣譜(pu)種(zhong)(zhong)群(qun)的(de)(de)(de)組(zu)(zu)成結(jie)構，可以通(tong)過 PICRUSt 等方法(fa)預測(ce)(ce)(ce)菌(jun)群(qun)整(zheng)體(ti)所(suo)具(ju)有的(de)(de)(de)潛在功(gong)能(neng)(neng)(neng)特(te)性，關(guan)(guan)注的(de)(de)(de)對象并不局限(xian)于執行某(mou)一類(lei)特(te)定(ding)功(gong)能(neng)(neng)(neng)的(de)(de)(de)微(wei)生物。

功能基因測序

二、宏基因組與宏轉錄組常見問題

1.宏(hong)基因組與微生(sheng)物多樣(yang)性和宏(hong)轉錄組的主要區別是什(shen)么？我設計實驗的時候該如何(he)選擇？

答：微(wei)生(sheng)物多樣性與宏基因(yin)組(zu)和宏轉錄組(zu)的區別如下

2.人體或動物(wu)的(de)(de)共(gong)生菌群進行宏基因組/宏轉錄組測(ce)序(xu)，會不會有宿(su)主序(xu)列(lie)的(de)(de)污染(ran)?

答(da)：會受到(dao)宿主序列污染的，但污染程度根據實(shi)際情(qing)況，可能或大或小。為盡量避免(mian)宿主的序列干(gan)擾(rao)，

我們建議從兩個方(fang)面進(jin)行優(you)化:

1)取(qu)樣過程中，盡量避免(mian)取(qu)到宿主(zhu)的組織(zhi);

2)適當提升測(ce)(ce)序數據(ju)量，測(ce)(ce)序完成后(hou)，可以(yi)將測(ce)(ce)序數據(ju)與宿(su)主的參考基因組進行(xing)比對(dui)，過(guo)濾來源于宿(su)主的序列，將過(guo)濾后(hou)的數據(ju)應用于后(hou)續分析。

3.為什么宏基因組與多樣性組成譜的物(wu)種注釋結果存在差異?

答：無論是宏基(ji)因組，還(huan)是多樣(yang)性(xing)組成(cheng)譜(pu)，都會分(fen)(fen)析群落(luo)樣(yang)本中物(wu)種的(de)種類(lei)組成(cheng)和分(fen)(fen)布結構，但是物(wu)種的(de)豐(feng)度組成(cheng)未必一模一樣(yang)。一般情況下，兩種方法獲得的(de)優勢物(wu)種種類(lei)應該(gai)差別不大(da)，但是豐(feng)度上可能會可能存在少許差異(yi)。

究其(qi)原因(yin)(yin)(yin)(yin)，一(yi)方(fang)面(mian)是(shi)因(yin)(yin)(yin)(yin)為多樣性(xing)組(zu)成譜是(shi)基(ji)于核(he)糖體(ti)小亞基(ji)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)序(xu)列(lie)進行物(wu)(wu)種(zhong)注釋和豐(feng)度統計，但(dan)是(shi)在(zai)(zai)不同物(wu)(wu)種(zhong)中核(he)糖體(ti)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)拷貝數不一(yi)樣，這會(hui)帶來一(yi)些誤差;另一(yi)方(fang)面(mian)，多樣性(xing)組(zu)成譜需(xu)要對(dui)群落 DNA 進行 PCR擴增，一(yi)般是(shi)在(zai)(zai)屬水平(ping)進行物(wu)(wu)種(zhong)組(zu)成譜的(de)(de)解析，而(er)宏基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)是(shi)直(zhi)接對(dui)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)片(pian)段進行鳥槍法測(ce)(ce)序(xu)，然后通過(guo)拼接組(zu)裝來預測(ce)(ce)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)信(xin)息，進而(er)獲得(de)物(wu)(wu)種(zhong)組(zu)成譜，可(ke)以深入到(dao)(dao)種(zhong)水平(ping)，兩(liang)者的(de)(de)方(fang)法策略是(shi)截然不同的(de)(de)，因(yin)(yin)(yin)(yin)此也會(hui)對(dui)物(wu)(wu)種(zhong)的(de)(de)豐(feng)度組(zu)成產(chan)生一(yi)定影響(xiang)。其(qi)次，兩(liang)種(zhong)方(fang)法的(de)(de)測(ce)(ce)序(xu)深度是(shi)截然不同的(de)(de)，一(yi)般多樣性(xing)組(zu)成譜的(de)(de)測(ce)(ce)序(xu)量在(zai)(zai) 3~6萬條序(xu)列(lie)/樣本(ben)的(de)(de)水平(ping)，而(er)宏基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)一(yi)般是(shi)在(zai)(zai) 5~10G的(de)(de)測(ce)(ce)序(xu)數據量，因(yin)(yin)(yin)(yin)此測(ce)(ce)序(xu)深度也會(hui)導致檢測(ce)(ce)到(dao)(dao)的(de)(de)物(wu)(wu)種(zhong)種(zhong)類有所不同。

4.宏基因組(zu)/宏轉錄組(zu)測序，如何將功能和物種兩(liang)方面的信息對應起來?

答：宏(hong)(hong)(hong)基(ji)因(yin)組/宏(hong)(hong)(hong)轉錄(lu)(lu)組測序項(xiang)目，會根據測序數據，進(jin)行序列拼(pin)接，并將拼(pin)接到的(de)(de) Contig/Scaffold 序列進(jin)行基(ji)因(yin)預測,然后(hou)對(dui)這些基(ji)因(yin)，同時進(jin)行功(gong)(gong)能注釋和(he)(he)物(wu)種(zhong)注釋。也就是說(shuo)，無論(lun)是宏(hong)(hong)(hong)基(ji)因(yin)組，還是宏(hong)(hong)(hong)轉錄(lu)(lu)組項(xiang)目，只要獲(huo)得了基(ji)因(yin)信(xin)(xin)息(xi)，就可(ke)以同時掌握該基(ji)因(yin)編碼了什(shen)么(me)功(gong)(gong)能，又來源于哪些物(wu)種(zhong)，即:可(ke)以根據基(ji)因(yin)信(xin)(xin)息(xi)，將微(wei)生物(wu)的(de)(de)物(wu)種(zhong)組成(cheng)及其攜帶的(de)(de)功(gong)(gong)能通路信(xin)(xin)息(xi)對(dui)應(ying)起(qi)(qi)來。這里小派(pai)提醒大(da)家如果(guo)在(zai)派(pai)森諾做的(de)(de)宏(hong)(hong)(hong)基(ji)因(yin)組和(he)(he)宏(hong)(hong)(hong)轉錄(lu)(lu)組測序項(xiang)目可(ke)以使用派(pai)森諾基(ji)因(yin)云個性(xing)化創建數據集將物(wu)種(zhong)和(he)(he)功(gong)(gong)能對(dui)應(ying)起(qi)(qi)來哦！

派森諾基因(yin)云數據(ju)集創建流程

5.宏基因(yin)組(zu)/宏轉錄組(zu)測序，常(chang)用的(de)數(shu)據庫有哪(na)些？

答(da)：農學和醫學方向對宏基因組/宏轉(zhuan)錄組數據庫(ku)的應用有所不同(tong)。農學常用的數據庫(ku)包括MCycDB，NCycDB，PCycDB，SCycDB，CAZy，BacMet， PlasticDB等；

醫學(xue)常用(yong)的(de)數據庫(ku)包(bao)括PHI，VFDB，MicroPhenoDB等，同(tong)時也有一些(xie)農學(xue)和(he)醫學(xue)方向通用(yong)的(de)數據庫(ku)KEGG，eggNOG，GO，Swiss-Prot，Pfam，Metacyc等。派森諾宏基因組(zu)與宏轉錄(lu)基因云全新(xin)升級包(bao)含30+數據庫(ku)同(tong)時滿足農學(xue)和(he)醫學(xue)方向數據分析的(de)需求

派(pai)森諾宏基因組(zu)與宏轉錄組(zu)30+數據庫

三、其它常見問題

1.微生物組高通量測序，較基因芯片檢測的優勢在哪?

答：一(yi)般而言(yan)，基(ji)(ji)(ji)因(yin)芯片能檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)，高(gao)通(tong)(tong)(tong)量(liang)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)都(dou)能做;但反(fan)過(guo)來(lai)，高(gao)通(tong)(tong)(tong)量(liang)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)能檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)，基(ji)(ji)(ji)因(yin)芯片不一(yi)定(ding)能做。這是因(yin)為(wei)，基(ji)(ji)(ji)因(yin)芯片是通(tong)(tong)(tong)過(guo)與(yu)一(yi)組(zu)已知序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)核酸探針雜交進(jin)行定(ding)量(liang)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)，因(yin)此(ci)無(wu)法對未知的(de)(de)(de)(de)物(wu)(wu)(wu)種和基(ji)(ji)(ji)因(yin)進(jin)行檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)，且(qie)雜交檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)方法會存在較高(gao)的(de)(de)(de)(de)假陽性(xing);而高(gao)通(tong)(tong)(tong)量(liang)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)方法則能輕松解決芯片技術(shu)在檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)小(xiao)分子時遇到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)短序(xu)列(lie)、高(gao)度同源(yuan)等技術(shu)難題，同時測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)方法還能檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)到(dao)(dao)未知的(de)(de)(de)(de)物(wu)(wu)(wu)種和基(ji)(ji)(ji)因(yin)片段信息。隨著高(gao)通(tong)(tong)(tong)量(liang)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)的(de)(de)(de)(de)通(tong)(tong)(tong)量(liang)越來(lai)越大、成本越來(lai)越低，測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)技術(shu)在微(wei)(wei)生物(wu)(wu)(wu)組(zu)研究領域的(de)(de)(de)(de)應用(yong)，也越來(lai)越廣泛，已成為(wei)微(wei)(wei)生物(wu)(wu)(wu)組(zu)研究的(de)(de)(de)(de)常規檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)手段。

2.微生物(wu)組測序完成后是否需(xu)要驗(yan)證?可(ke)以(yi)用(yong) qPCR 方(fang)法驗(yan)證嗎?

答：可(ke)以(yi)通(tong)過熒光(guang)定量(liang)PCR(GPCR)進行驗證。一(yi)般(ban)而(er)言，qPCR獲(huo)得的(de)是(shi)微生物的(de)絕對(dui)(dui)豐度，而(er)測序技術(shu)一(yi)般(ban)獲(huo)得的(de)是(shi)群(qun)落中(zhong)不同物種/基因/轉錄本的(de)相對(dui)(dui)豐度百分比(bi)，因此，這(zhe)兩種方法并(bing)不完全(quan)一(yi)致(zhi)，但可(ke)以(yi)相互印證。

如(ru)果是(shi)進行多樣性(xing)(xing)組(zu)(zu)成譜或者(zhe)功(gong)能基(ji)因(yin)(yin)測序(xu)，可(ke)以針對(dui)總菌數或者(zhe)某一類(lei)特定的(de)微(wei)生物(wu)類(lei)群的(de)絕對(dui)豐度設(she)(she)計特異(yi)性(xing)(xing)引物(wu)進行驗(yan)(yan)證;而對(dui)于(yu)宏基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)/宏轉錄組(zu)(zu)而言，則可(ke)以針對(dui)某一類(lei)功(gong)能基(ji)因(yin)(yin)或對(dui)應的(de)轉錄本(ben)(ben)，設(she)(she)計引物(wu)驗(yan)(yan)證其基(ji)因(yin)(yin)拷貝(bei)數或轉錄本(ben)(ben)表達(da)量(liang)的(de)變(bian)化(hua)。

3.微生物(wu)組測序是否需要生物(wu)學重復?重復幾次?

答：需要(yao)。一(yi)般(ban)而言，微生(sheng)物群落樣(yang)(yang)本(ben)總是存在一(yi)定(ding)的(de)(de)隨(sui)機性(xing)和不均一(yi)性(xing)，而設置(zhi)生(sheng)物學重(zhong)(zhong)復(fu)將有助于評估樣(yang)(yang)本(ben)間(jian)差異(yi)程度，同時增強(qiang)結果的(de)(de)可靠(kao)性(xing)。測(ce)序的(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)數越(yue)多(duo)，越(yue)能夠(gou)降低組內樣(yang)(yang)本(ben)差異(yi)而引入(ru)的(de)(de)影(ying)響(xiang)。此外(wai)，足(zu)夠(gou)數量(liang)的(de)(de)生(sheng)物學重(zhong)(zhong)復(fu)，還有助于檢測(ce)離群樣(yang)(yang)本(ben)，因為(wei)異(yi)常樣(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)存在，會嚴重(zhong)(zhong)影(ying)響(xiang)檢測(ce)結果的(de)(de)準確性(xing)。在生(sheng)物學重(zhong)(zhong)復(fu)數量(liang)足(zu)夠(gou)的(de)(de)情況(kuang)下，通(tong)過分析菌群組成、Alpha和 Beta 多(duo)樣(yang)(yang)性(xing)指數，可以發現異(yi)常樣(yang)(yang)本(ben)，將其剔除。

如(ru)果樣(yang)(yang)本的(de)類(lei)型是(shi)動植物(wu)(wu)(wu)樣(yang)(yang)本，如(ru)腸道內容(rong)物(wu)(wu)(wu)或糞便樣(yang)(yang)本、組織樣(yang)(yang)本等，個體(ti)間(jian)差異較大，建(jian)議 10個以上生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)學(xue)重復(fu);如(ru)果樣(yang)(yang)本的(de)類(lei)型是(shi)環境樣(yang)(yang)本,如(ru)土(tu)壤、水體(ti)、空氣等,建(jian)議6個以上生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)學(xue)重復(fu);提高生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)學(xue)重復(fu)的(de)數量可(ke)以大大減(jian)小(xiao)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)個體(ti)間(jian)存在的(de)誤差。

4.微生物組(zu)樣本的采(cai)集和運輸有什么要求？

答：不同(tong)樣本的(de)(de)(de)微(wei)生物組(zu)樣本的(de)(de)(de)采集(ji)是不同(tong)的(de)(de)(de)，部(bu)分(fen)樣本的(de)(de)(de)采集(ji)需要特殊的(de)(de)(de)方法。農(nong)學(xue)和醫(yi)學(xue)具體的(de)(de)(de)樣本的(de)(de)(de)采集(ji)方法可以咨詢派森(sen)諾當地的(de)(de)(de)銷售小(xiao)伙伴(ban)獲取。

派森(sen)諾微生物組農學(xue)和醫學(xue)取樣(yang)方法