2025-01-20
單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)多組(zu)學技術在近年(nian)來快速發(fa)(fa)展，已成為(wei)揭示復雜生物學過(guo)程的(de)(de)重(zhong)要工具。過(guo)去(qu)的(de)(de)研究中(zhong)，主要采用了(le)(le)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)RNA測序（scRNA-seq）來分析(xi)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)層面的(de)(de)基(ji)因表(biao)(biao)達。然(ran)而，這類方法無法同(tong)(tong)時揭示基(ji)因組(zu)染色質(zhi)(zhi)結構(gou)與(yu)RNA異(yi)構(gou)體(ti)之間的(de)(de)復雜關系。RNA異(yi)構(gou)體(ti)的(de)(de)多樣性(xing)(xing)決(jue)定了(le)(le)基(ji)因的(de)(de)可變功(gong)能(neng)，進而影響細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)表(biao)(biao)型復雜性(xing)(xing)。與(yu)此同(tong)(tong)時，表(biao)(biao)觀遺傳修飾(shi)顯著增強(qiang)了(le)(le)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)間的(de)(de)異(yi)質(zhi)(zhi)性(xing)(xing)，并(bing)且(qie)近期研究表(biao)(biao)明，表(biao)(biao)觀遺傳修飾(shi)在選(xuan)擇(ze)性(xing)(xing)剪(jian)接（AS）事件(jian)中(zhong)發(fa)(fa)揮著重(zhong)要作(zuo)用。然(ran)而，目前仍(reng)缺乏有(you)效的(de)(de)技術手段(duan)，能(neng)夠在單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)層面同(tong)(tong)時分析(xi)基(ji)因組(zu)RNA異(yi)構(gou)體(ti)與(yu)表(biao)(biao)觀遺傳狀態。
2024年9月，中(zhong)山(shan)大(da)學胡友金教授團隊在Nature Communications雜志在線發表題為“Simultaneous profiling of RNA isoforms and chromatin accessibility of single cells of human retinal organoids”研究論(lun)文。因(yin)(yin)此作者在他們之(zhi)前開發的(de)方法scRCAT-seq基(ji)礎上和單細胞ATAC-seq整合進(jin)一(yi)步開發了(le)可同(tong)時分析(xi)同(tong)一(yi)單細胞內的(de)染色質(zhi)可及性和全長(chang)RNA異構體的(de)方法scRICA-seq。作者利用scRICA-seq繪制了(le)人類(lei)視網膜類(lei)器官的(de)多組學景觀(guan)，揭(jie)示了(le)染色質(zhi)可及性和RNA剪接(jie)對(dui)介導(dao)人類(lei)視網膜類(lei)器官內神經元發育(yu)和再(zai)生的(de)關鍵命運決定(ding)基(ji)因(yin)(yin)的(de)一(yi)致調控。
PART1、技(ji)術(shu)原理
scRICA-seq技術基于從(cong)同(tong)一(yi)單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)并行(xing)捕獲DNA和RNA，旨(zhi)在同(tong)時分析同(tong)一(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內的染(ran)(ran)色(se)質可及性(xing)、RNA表(biao)達及RNA異構體。為(wei)實現DNA和RNA的并行(xing)捕獲與測序(xu)，作(zuo)者采(cai)用了兩種策略：對于低通(tong)量單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣本(ben)，研(yan)(yan)究團(tuan)隊利用之前開發的核(he)(he)-細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)質分離方法，從(cong)同(tong)一(yi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)獲取細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)和細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)質RNA；而對于高通(tong)量單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)群體，研(yan)(yan)究團(tuan)隊則采(cai)用微(wei)流(liu)控系統，可以同(tong)時分析單(dan)個細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)中(zhong)的染(ran)(ran)色(se)質可及性(xing)與轉錄組(zu)（圖1a）。
為了(le)對(dui)全長(chang)RNA異構(gou)體(ti)的(de)(de)單(dan)細胞(bao)轉(zhuan)錄組(zu)進行分(fen)析，作者進一(yi)步(bu)優化了(le)先(xian)前的(de)(de)方法，開發了(le)新型的(de)(de)scRCAT-seq2技術。圖1b展(zhan)示(shi)了(le)scRCAT-seq2的(de)(de)具體(ti)流程，主要包括以下(xia)步(bu)驟：（1）使(shi)用唯一(yi)分(fen)子(zi)(zi)標識(shi)符(fu)（UMI）標記單(dan)個(ge)RNA/cDNA分(fen)子(zi)(zi)的(de)(de)末端(duan)；（2）通過(guo)(guo)端(duan)到端(duan)連接構(gou)建(jian)環(huan)狀(zhuang)cDNA；（3）進行滾環(huan)擴(kuo)增，以生(sheng)成多(duo)個(ge)全長(chang)cDNA的(de)(de)拷貝；（4）使(shi)用Tn5轉(zhuan)座酶在(zai)環(huan)狀(zhuang)全長(chang)cDNA上隨機插(cha)入，將(jiang)其片段(duan)(duan)(duan)化；（5）構(gou)建(jian)文庫并對(dui)片段(duan)(duan)(duan)進行雙端(duan)測序；（6）整(zheng)合具有相同UMI的(de)(de)短讀(du)段(duan)(duan)(duan)，將(jiang)這(zhe)些(xie)短讀(du)段(duan)(duan)(duan)映射到特(te)定(ding)的(de)(de)異構(gou)體(ti)特(te)征，包括轉(zhuan)錄起始位(wei)點（TSS）、轉(zhuan)錄終止位(wei)點（TES）以及特(te)定(ding)外(wai)顯子(zi)(zi)。最后，通過(guo)(guo)UMI標記將(jiang)每(mei)個(ge)短讀(du)段(duan)(duan)(duan)分(fen)配到特(te)定(ding)的(de)(de)RNA異構(gou)體(ti)，并利用測序數據對(dui)異構(gou)體(ti)進行重構(gou)。
圖(tu)1 scRICA-seq技(ji)術的(de)工(gong)作流程及其(qi)應用(yong)示意圖(tu)
PART2、主(zhu)要結果
1、scRCAT-seq2在(zai)實驗中的表現
scRCAT-seq2的(de)(de)短讀(du)長可以有(you)效覆蓋全長轉(zhuan)錄本(ben)，包(bao)括TSS、TES和外(wai)顯子（圖(tu)(tu)2a）。作者加(jia)入了包(bao)含92個ERCC和69個異構(gou)體的(de)(de)RNA標(biao)準(zhun)(zhun)集（SIRV-set 3）作為(wei)真實值(zhi)對照(zhao)用以評估scRCAT-seq2在識別和量化單(dan)細胞(bao)內(nei)異構(gou)體方面的(de)(de)靈(ling)敏度(du)(du)和準(zhun)(zhun)確(que)(que)性(xing)，scRCAT-seq2可以識別61個SIRV轉(zhuan)錄本(ben)，靈(ling)敏度(du)(du)為(wei)88%，全長特征揭(jie)示準(zhun)(zhun)確(que)(que)率為(wei)100%（圖(tu)(tu)2b，c）。此(ci)外(wai)，作者觀察(cha)到單(dan)個細胞(bao)之(zhi)間ERCC表達(da)的(de)(de)高度(du)(du)相關(guan)性(xing)，以及觀察(cha)到的(de)(de)豐度(du)(du)與預期值(zhi)的(de)(de)高度(du)(du)一致性(xing)（圖(tu)(tu)2d，e）。我們還發(fa)現單(dan)個細胞(bao)之(zhi)間的(de)(de)基(ji)因和異構(gou)體存在很強的(de)(de)相關(guan)性(xing)（圖(tu)(tu) 2f），表明 scRCAT-seq2 數(shu)據具有(you)很高的(de)(de)一致性(xing)。
作者將scRCAT-seq2的(de)性能(neng)(neng)與其他(ta)能(neng)(neng)夠(gou)在單細胞(bao)水平(ping)異構(gou)(gou)體檢測(ce)方(fang)法進行了比較，包括基(ji)于PacBio長讀長測(ce)序(xu)的(de)ScISOr-seq和(he)HITscISO-seq、基(ji)于Nanopore長讀長測(ce)序(xu)的(de)SCAN-seq2和(he)scCOLOR-seq，以及(ji)基(ji)于短讀長測(ce)序(xu)的(de)scRCAT-seq。觀察到，在相同(tong)成本(ben)的(de)不同(tong)測(ce)序(xu)深度中，scRCAT-seq2在檢測(ce)單細胞(bao)異構(gou)(gou)體方(fang)面具有(you)最高的(de)靈(ling)敏度和(he)效率(lv)（圖(tu)2g）。
圖2 scRCAT-seq2的性能表(biao)現
2、構建基于scRICA-seq數據的人類視網膜類器(qi)官的多(duo)組學單細(xi)胞圖譜(pu)
研(yan)究者將scRICA-seq應用于人(ren)類(lei)(lei)視(shi)(shi)網(wang)(wang)膜(mo)(mo)發育過程(cheng)，構(gou)建了(le)人(ren)類(lei)(lei)視(shi)(shi)網(wang)(wang)膜(mo)(mo)類(lei)(lei)器官的(de)單細胞(bao)多(duo)組學(xue)圖(tu)譜。基(ji)于單細胞(bao)異構(gou)體的(de)聚(ju)類(lei)(lei)分析，確定(ding)了(le)六(liu)個細胞(bao)簇(cu)，對應于六(liu)種典(dian)型(xing)的(de)視(shi)(shi)網(wang)(wang)膜(mo)(mo)早期(qi)神經元，包(bao)括視(shi)(shi)網(wang)(wang)膜(mo)(mo)祖(zu)細胞(bao)（RPCs）、視(shi)(shi)網(wang)(wang)膜(mo)(mo)神經節細胞(bao)（RGCs）、無長(chang)突(tu)細胞(bao)/水(shui)平細胞(bao)（AC/HCs）、視(shi)(shi)錐(zhui)細胞(bao)前(qian)體（PR precursors）、神經生(sheng)成RPCs（neurogenic RPCs）以及視(shi)(shi)錐(zhui)細胞(bao)（cones），其結果與scRNA-seq技術(shu)所(suo)得(de)數據高度一致。
圖(tu)(tu)3 基于(yu)scRICA-seq數據的人類視網(wang)膜類器官的多組學(xue)單細胞(bao)圖(tu)(tu)譜
3、染色質可及(ji)性與視網膜祖細胞（RPC）分化為視錐細胞過程中RNA轉(zhuan)錄之間的關系
圖(tu)(tu)4a通過(guo)偽時(shi)間分析展示(shi)(shi)(shi)了(le)RPC向視錐細胞發育(yu)的軌跡，并在圖(tu)(tu)4b中(zhong)(zhong)(zhong)揭示(shi)(shi)(shi)了(le)這一過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)基因表(biao)(biao)達與染色質可及性(xing)(xing)的顯(xian)著變化。圖(tu)(tu)4c至(zhi)4f則展示(shi)(shi)(shi)了(le)不同基因和異構體(ti)在RPC分化為視錐細胞過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)的動(dong)態變化。圖(tu)(tu)4g至(zhi)4i進一步揭示(shi)(shi)(shi)了(le)關(guan)(guan)鍵基因（如NRL、CRX和SOX2）在這一過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)染色質開放性(xing)(xing)與基因表(biao)(biao)達水平(ping)之間的相關(guan)(guan)性(xing)(xing)。這些結果清晰地表(biao)(biao)明，染色質可及性(xing)(xing)在視網膜(mo)細胞命運決定過(guo)程(cheng)(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)發揮了(le)關(guan)(guan)鍵作用(yong)。
圖4 染色質可及性與(yu)RPC命運決定因子的RNA轉錄相關
4、RNA異(yi)構體選擇與染色質可及性(xing)及轉錄因子（TF）之(zhi)間(jian)的(de)關系(xi)
進一步，作(zuo)者(zhe)研究了(le)RPC分(fen)化為cone過程中(zhong)RNA isoform的(de)(de)(de)(de)動態(tai)選(xuan)擇模(mo)式，發現cone和(he)(he)(he)RPC之間共有2292種差異表(biao)達的(de)(de)(de)(de)isoform，其中(zhong)1143種isoform在(zai)(zai)cone中(zhong)高度表(biao)達，1149種在(zai)(zai)RPC中(zhong)高度表(biao)達。通過轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)motif分(fen)析，研究者(zhe)預(yu)(yu)測(ce)了(le)589個可(ke)能(neng)與這些動態(tai)調節(jie)的(de)(de)(de)(de)剪接(jie)位點結合(he)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)。在(zai)(zai)預(yu)(yu)測(ce)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)中(zhong)包含了(le)11種先(xian)前(qian)報道的(de)(de)(de)(de)參(can)與調節(jie)RNA剪接(jie)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)，包括NEUROD1、SP1和(he)(he)(he)KLF4等，同(tong)時還包含了(le)已知的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞命運(yun)(yun)決(jue)定(ding)因(yin)子(zi)，如(ru)NEUROD1、ASCL1和(he)(he)(he)THRB等。這提(ti)示，剪接(jie)位點染(ran)色質可(ke)及性的(de)(de)(de)(de)動態(tai)變化與RNA剪接(jie)可(ke)能(neng)協同(tong)調控細(xi)胞命運(yun)(yun)決(jue)定(ding)
圖5 RPC發育過(guo)程中RNA異構體選擇與染色質可及性和(he)TF的相(xiang)關性
PART3、總(zong) 結
綜(zong)上，該研究(jiu)發展了一種(zhong)單(dan)細胞(bao)(bao)多組學方法(fa)scRICA-seq，在單(dan)細胞(bao)(bao)水平實現了表觀(guan)遺傳學、RNA轉錄和剪接的整合(he)分析，能夠全(quan)面分析了染色(se)質可及性、RNA表達和差異異構體選擇之間(jian)的相關性。利用(yong)scRICA-seq，檢測到了視(shi)網(wang)膜(mo)祖細胞(bao)(bao)（RPC）、視(shi)網(wang)膜(mo)神經元、感光細胞(bao)(bao)前體以(yi)及其他視(shi)網(wang)膜(mo)相關細胞(bao)(bao)類型的特異性基因和異構體表達模式，為進一步理解視(shi)網(wang)膜(mo)的發育機制奠(dian)定了基礎。
