由于(yu)(yu)下一(yi)代(dai) RNA 測序具(ju)有高(gao)靈敏(min)度、成本(ben)效益和通用(yong)(yong)性等優點，它(ta)在(zai)研究宿(su)(su)(su)主(zhu)-微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)相互(hu)作用(yong)(yong)方面(mian)一(yi)直頗受(shou)歡迎。關于(yu)(yu)宿(su)(su)(su)主(zhu)-微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)相互(hu)作用(yong)(yong)的(de)分(fen)(fen)析經歷了(le)三個(ge)主(zhu)要(yao)階段(duan)(duan)（圖 1）。在(zai)第一(yi)階段(duan)(duan)，宿(su)(su)(su)主(zhu)細胞和細菌(jun)細胞被(bei)物(wu)(wu)理分(fen)(fen)離(li)，然(ran)后(hou)分(fen)(fen)別對它(ta)們的(de)轉錄組進行分(fen)(fen)析。第二階段(duan)(duan)始(shi)于(yu)(yu)研究者認識到(dao) RNA-seq 的(de)高(gao)分(fen)(fen)辨能(neng)力和內(nei)在(zai)的(de)單核(he)苷酸分(fen)(fen)辨率，使(shi)其成為同(tong)時(shi)檢(jian)測和定量來自不(bu)同(tong)相互(hu)作用(yong)(yong)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)體轉錄本(ben)的(de)一(yi)種極其強大的(de)技術。目前的(de)第三階段(duan)(duan)以(yi)越來越多地使(shi)用(yong)(yong)單細胞 RNA-seq來剖析宿(su)(su)(su)主(zhu) - 微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)相互(hu)作用(yong)(yong)中的(de)細胞異質性為標志。

圖(tu)1 宿(su)主(zhu)-微生物相互作用

其中(zhong)互作轉(zhuan)錄組測序（Dual RNA-seq）是2012年興起的(de)(de)(de)(de)技術(shu)，其通過RNA-seq反映兩(liang)個生物間(jian)的(de)(de)(de)(de)互作關系，是繼單物種轉(zhuan)錄組后RNA家族(zu)的(de)(de)(de)(de)一(yi)顆極具發展潛力的(de)(de)(de)(de)正在升起的(de)(de)(de)(de)新星(xing)，也是RNA領域最新的(de)(de)(de)(de)研究熱點。互作轉(zhuan)錄組測序在抗病或(huo)致病機(ji)理研究、新藥(yao)開發、農業病害研究和(he)防治、物種進化和(he)生理適應等領域具有廣泛的(de)(de)(de)(de)應用前景。

互(hu)作(zuo)轉(zhuan)錄組(zu)測序可(ke)以同時對互(hu)作(zuo)的(de)(de)兩(liang)個(ge)物種進行建(jian)庫測序，更能反映宿(su)主(zhu)和(he)(he)病原體真實的(de)(de)表達情(qing)況(kuang)。可(ke)以通(tong)過互(hu)作(zuo)轉(zhuan)錄組(zu)研究宿(su)主(zhu)激活相應(ying)通(tong)路來適應(ying)和(he)(he)殺(sha)死細菌的(de)(de)機制；以及(ji)研究細菌表達某(mou)些(xie)特定基因(yin)，從(cong)而確保其(qi)在植物體內生存(cun)和(he)(he)復制的(de)(de)機制。

圖2 互(hu)作轉(zhuan)錄組

一、互(hu)作轉錄組應用方向

醫學領域

1、研究病原體致病機(ji)制：通過比較病(bing)原體感染(ran)宿主前后，雙方(fang)轉(zhuan)錄組(zu)的變化，可確定病(bing)原體致病(bing)所需的分子(zi)過程，有助于開發新的藥物(wu)和治療方(fang)法(fa)，也可以預測(ce)某些(xie)疾病(bing)的發生風險(xian)。

2、探索宿主免疫應(ying)答機制：了解宿主在感染(ran)病原體后，哪(na)些(xie)基因被(bei)激活或(huo)抑制，從而揭示宿主的免(mian)疫(yi)防御機制，為(wei)免(mian)疫(yi)治療(liao)等提供理論(lun)依(yi)據。

農業領域

1、動植(zhi)物病(bing)蟲害防治：研究動植(zhi)物(wu)與病原菌、害蟲(chong)之間的互作轉(zhuan)錄組，挖掘動植(zhi)物(wu)的抗(kang)病蟲(chong)基(ji)(ji)因以及(ji)病原菌、害蟲(chong)的致病、致害基(ji)(ji)因，為培育抗(kang)病蟲(chong)動植(zhi)物(wu)品種提供(gong)靶點，也可為開(kai)發(fa)新型(xing)生物(wu)防(fang)治(zhi)手段提供(gong)理論支持(chi)。

2、生物共生關(guan)系研究：對于共(gong)生(sheng)(sheng)生(sheng)(sheng)物，如地衣(yi)中(zhong)的真菌與藻類、豆科植(zhi)物與根瘤菌等，互作(zuo)轉錄組可揭示它們在(zai)共(gong)生(sheng)(sheng)過程中(zhong)的基因(yin)表達調(diao)控，理解(jie)共(gong)生(sheng)(sheng)關系的建立和維持(chi)機制。

二 、互作轉錄組(zu)測序方案設計(ji)

互(hu)作轉錄組(zu)(zu)實驗設計(ji)思路是(shi)互(hu)作樣(yang)(yang)(yang)本(ben)中的物(wu)(wu)種與(yu)各(ge)自物(wu)(wu)種的對(dui)照(zhao)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)進行(xing)差異(yi)比較。互(hu)作轉錄組(zu)(zu)標準的樣(yang)(yang)(yang)本(ben)構成為兩(liang)個物(wu)(wu)種的對(dui)照(zhao)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)以及互(hu)作樣(yang)(yang)(yang)本(ben)。與(yu)常(chang)規轉錄組(zu)(zu)不同的是(shi)互(hu)作轉錄組(zu)(zu)對(dui)互(hu)作樣(yang)(yang)(yang)本(ben)中的兩(liang)個物(wu)(wu)種同時取樣(yang)(yang)(yang)、提取RNA、建庫、上機測(ce)序(xu)。最(zui)后獲取兩(liang)個物(wu)(wu)種RNA的測(ce)序(xu)結果并分(fen)別(bie)與(yu)這(zhe)兩(liang)個物(wu)(wu)種的對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)進行(xing)后續轉錄組(zu)(zu)分(fen)析。互(hu)作樣(yang)(yang)(yang)本(ben)取樣(yang)(yang)(yang)部位需要精確，應同時取到互(hu)作物(wu)(wu)種；每一(yi)組(zu)(zu)樣(yang)(yang)(yang)品建議至少3個生物(wu)(wu)學(xue)重復(fu)，并加大(da)互(hu)作樣(yang)(yang)(yang)本(ben)的測(ce)序(xu)量。

三、技(ji)術路線

1、常(chang)規互作(zuo)轉錄組思路-兩個(ge)物種(zhong)互作(zuo)

圖(tu)3 思路圖(tu)

①一(yi)(yi)個(ge)時間點；一(yi)(yi)種宿主；一(yi)(yi)種互作

②多個時間點(dian)；一種宿(su)主；一種互作

doi: 10.1016/j.csbj.2021.04.008.

2、多個物(wu)種互(hu)作

③一個時間點；多種宿主；多種互(hu)作 (如植物易感、抗病(bing))

④一個(ge)時間點；一種宿主；多(duo)種互(hu)作（如(ru)菌強致病(bing)、弱致病(bing)）

⑤多個時間點；一(yi)種宿主；多種互作

doi: 10.1371/journal.pone.0103098.

⑥多(duo)(duo)個時間點；多(duo)(duo)種宿主；多(duo)(duo)種互作

doi: 10.3390/microorganisms7090315.

代(dai)表微生物

代(dai)表宿主

四、項(xiang)目文章

1、互作轉錄組(zu)測序助力揭(jie)示(shi)內(nei)生細菌促進寄(ji)主植物生長機制：

Endophytic Bacillus altitudinis Strain Uses Different Novelty Molecular Pathways to Enhance Plant Growth

期刊：Frontiers in Microbiology

研究背景：

植(zhi)(zhi)物(wu)內(nei)(nei)生細(xi)菌(jun)的(de)(de)(de)鑒定和利用是可(ke)持續(xu)農業發展的(de)(de)(de)重要目標。在自(zi)然界中，植(zhi)(zhi)物(wu)可(ke)以與多種促(cu)進植(zhi)(zhi)物(wu)生長(chang)的(de)(de)(de)內(nei)(nei)生細(xi)菌(jun)共存，這些細(xi)菌(jun)可(ke)通過增強寄主的(de)(de)(de)養(yang)分獲(huo)取(qu)、固氮、獲(huo)取(qu)鐵(tie)和產生鐵(tie)載體的(de)(de)(de)能力來促(cu)進寄主生長(chang)，也有(you)研究認為，內(nei)(nei)生細(xi)菌(jun)能產生促(cu)生長(chang)的(de)(de)(de)植(zhi)(zhi)物(wu)激素，如(ru)IAA、ACC等。然而目前內(nei)(nei)生細(xi)菌(jun)促(cu)進寄主生長(chang)的(de)(de)(de)分子機制仍無定論。

野生(sheng)植物(wu)(wu)面臨著復雜多(duo)變的(de)生(sheng)存環(huan)境和(he)脅(xie)迫條件，從這類(lei)物(wu)(wu)種中(zhong)分(fen)離(li)出的(de)內生(sheng)細菌更(geng)有可能促(cu)進(jin)多(duo)種植物(wu)(wu)生(sheng)長(chang)。因(yin)此，本研究(jiu)旨(zhi)在從野生(sheng)植物(wu)(wu)中(zhong)分(fen)離(li)和(he)鑒定內生(sheng)細菌，并(bing)對其促(cu)進(jin)植物(wu)(wu)生(sheng)長(chang)的(de)特性和(he)參與內生(sheng)細菌-植物(wu)(wu)相互(hu)作(zuo)用的(de)主要分(fen)子事件進(jin)行(xing)研究(jiu)。

結(jie)果：

本研究從野生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)植(zhi)物(wu)中華甜茅中分離并鑒定了(le)一種(zhong)新(xin)的內生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)細(xi)菌(jun)：SB001。通過16S rDNA測(ce)序，該細(xi)菌(jun)被(bei)鑒定為高原芽孢桿(gan)菌(jun)。溫室實驗證(zheng)明(ming)，內生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)菌(jun)SB001能促(cu)(cu)(cu)進(jin)不(bu)同(tong)植(zhi)物(wu)的生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長。轉錄組測(ce)序結果表(biao)明(ming)，成熟酶K、TPR樣超家(jia)族蛋白(bai)、LOB結構域蛋白(bai)和BTB/POZ/TAZ結構域蛋白(bai)可能參與(yu)(yu)了(le)內生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)菌(jun)SB001對擬南芥的促(cu)(cu)(cu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)作(zuo)(zuo)用；此外，在(zai)內生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)菌(jun)中發現了(le)與(yu)(yu)植(zhi)物(wu)相互作(zuo)(zuo)用過程中主要促(cu)(cu)(cu)進(jin)因子(zi)：MFS轉運體和DNA旋轉酶亞基B。這些(xie)新(xin)發現表(biao)明(ming)，內生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)菌(jun)SB001可作(zuo)(zuo)為促(cu)(cu)(cu)進(jin)植(zhi)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長的有(you)利候選源，在(zai)可持(chi)續農業中發揮重要作(zuo)(zuo)用。

圖(tu)4 主要結果

2、互作轉錄組測序助力探究(jiu)宿主(zhu)-寄生(sheng)蟲(chong)相關基(ji)因調控網絡(luo)

Temporal transcriptome change of Oncomelania hupensis revealed by Schistosoma japonicum invasion

期刊：Cell & Bioscience

研究背景：

血(xue)(xue)吸(xi)蟲病是(shi)(shi)全球廣泛影(ying)響(xiang)的(de)(de)人(ren)畜共患寄生(sheng)(sheng)蟲病，湖北釘螺是(shi)(shi)日本(ben)血(xue)(xue)吸(xi)蟲的(de)(de)唯一中(zhong)(zhong)間(jian)宿主，其(qi)分(fen)布及繁殖影(ying)響(xiang)疾(ji)病傳播。血(xue)(xue)吸(xi)蟲生(sheng)(sheng)活周(zhou)期復雜，感(gan)染(ran)受多種因素影(ying)響(xiang)，血(xue)(xue)吸(xi)蟲 - 釘螺相互作用(yong)(yong)是(shi)(shi)關(guan)鍵研究領域。涉(she)及寄生(sheng)(sheng)蟲-釘螺相互作用(yong)(yong)的(de)(de)關(guan)鍵分(fen)子機制以(yi)及中(zhong)(zhong)間(jian)宿主感(gan)染(ran)建立過程中(zhong)(zhong)發生(sheng)(sheng)的(de)(de)主要分(fen)子事件目前(qian)還沒(mei)有(you)得到(dao)研究。本(ben)研究通過對感(gan)染(ran)寄生(sheng)(sheng)蟲后第7天和第30天的(de)(de)釘螺進行高通量測序以(yi)探(tan)究此問題。

結果：

發現了5000多(duo)個差異表(biao)達基因(yin)，差異基因(yin)參與了生(sheng)物調(diao)節和先天免疫(yi)通路相關(guan)的(de)關(guan)鍵(jian)過程。使用WGCNA，識別(bie)出16個模塊(kuai)，一個參與RNA結合(he)、翻譯、mRNA加工和核(he)糖體(ti)(ti)結構組成的(de)模塊(kuai)與日(ri)本血(xue)吸(xi)蟲的(de)入(ru)侵密切相關(guan)。KEGG通路的(de)許多(duo)基因(yin)參與了溶酶體(ti)(ti)、剪接體(ti)(ti)和核(he)糖體(ti)(ti)，提示(shi)日(ri)本血(xue)吸(xi)蟲入(ru)侵可(ke)能激活了血(xue)吸(xi)蟲核(he)糖體(ti)(ti)的(de)調(diao)控(kong)和免疫(yi)應答。主要差異基因(yin)的(de)表(biao)達模式(shi)和推測的(de)關(guan)鍵(jian)調(diao)控(kong)途徑將為構建宿主-寄(ji)生(sheng)蟲相關(guan)基因(yin)調(diao)控(kong)網絡提供有用的(de)信息。

圖5 主要結果

常見問題

1、互作轉錄組測序是怎么做的？

互作(zuo)轉(zhuan)錄組(zu)可同時提取互作(zuo)樣(yang)(yang)(yang)本中兩個(ge)物種(zhong)的(de)RNA，構(gou)建同一個(ge)文庫并上機測(ce)序(xu)(xu)。同時，分(fen)別對(dui)兩物種(zhong)的(de)對(dui)照樣(yang)(yang)(yang)本進行常規轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)(xu)。將(jiang)(jiang)互作(zuo)樣(yang)(yang)(yang)本的(de)測(ce)序(xu)(xu)數(shu)據與互作(zuo)物種(zhong)的(de)基因組(zu)比對(dui)，將(jiang)(jiang)比對(dui)上的(de)部分(fen)再(zai)分(fen)別與兩物種(zhong)對(dui)照樣(yang)(yang)(yang)本的(de)測(ce)序(xu)(xu)數(shu)據進行生信分(fen)析，從而得到互作(zuo)物種(zhong)基因表達變化。

2、互(hu)作(zuo)轉(zhuan)錄組(zu)文庫如何構建(jian)？

（1）真核(he)+真核(he)互作：釣取真核(he)生物特有polyA尾的方式，同時獲(huo)得(de)兩(liang)物種的mRNA。

（2）真核+原(yuan)核互作：分別剔除真核生物和(he)原(yuan)核生物的rRNA。

（3）原(yuan)核+原(yuan)核互作：剔除原(yuan)核生(sheng)物的rRNA。

3、互(hu)作轉錄組與常規轉錄組的區別？

（1）互(hu)作轉錄組要求取樣更精確，應精準取到(dao)互(hu)作部位

（2）互(hu)作(zuo)轉錄(lu)(lu)組(zu)建庫方(fang)法根據(ju)互(hu)作(zuo)物(wu)種的不(bu)同而相(xiang)應變化(hua)，可能會同時剔除(chu)真(zhen)核(he)(he)(he)和(he)原核(he)(he)(he)生物(wu)的rRNA；常規轉錄(lu)(lu)組(zu)只有(you)單一物(wu)種，分別使(shi)用(yong)真(zhen)核(he)(he)(he)和(he)原核(he)(he)(he)的建庫方(fang)法。

（3）互作轉(zhuan)(zhuan)錄組因包含兩個物(wu)種(zhong)(zhong)，需在常規轉(zhuan)(zhuan)錄組的基礎上增(zeng)大測序量，盡可能(neng)的測到互作樣本中(zhong)占比較小的物(wu)種(zhong)(zhong)。

（4）得到下機數(shu)據后，常(chang)規轉錄(lu)組(zu)直接與本(ben)物(wu)種的(de)基(ji)因(yin)組(zu)進行(xing)比對；互作轉錄(lu)組(zu)則分別與互作物(wu)種進行(xing)比對，使用比對到相應(ying)物(wu)種的(de)數(shu)據進行(xing)后續生信分析(xi)

4、互作轉錄(lu)組可以云平臺交付嗎(ma)？

真(zhen)(zhen)核(he)(he)有參轉錄組和原核(he)(he)轉錄組均可以使用云(yun)平臺交付，以下是真(zhen)(zhen)核(he)(he)和原核(he)(he)的分析結流程：

圖6 真核轉錄組分析流(liu)程

圖7 原核轉錄(lu)組分析流程