前言(yan)

單細胞轉錄組測序（Single cell RNA sequencing）：是在單細胞水平對轉錄組進行測序的一項新技術，可以研究單個細胞內的基因表達情況，同時解決用組織樣本測序無法解決的細胞異質性難題，讓解析單個細胞的行為、機制及其與機體的關系成為了現實。

特點與難點：單細胞轉錄組測序技術能讓我們獲取單個細胞的轉錄組信息，但單個細胞的轉錄本信息給出的龐大數據量，為后續的數據過濾、篩選、分析帶來了不少挑戰。

*目的與目標：以(yi)單細胞轉錄組測(ce)序(xu)得到的(de)，經細胞過濾后的(de)數(shu)據(ju)為例，對12個模(mo)塊，共20項分析(xi)條目(mu)拆(chai)解(jie)。從(cong)橫縱坐標(biao)含(han)義(yi)、應用、輸入輸出數(shu)據(ju)的(de)角度入手，面向初次接觸高通(tong)量測(ce)序(xu)的(de)讀(du)者，輔助(zhu)您實(shi)現(xian)高通(tong)量測(ce)序(xu)數(shu)據(ju)分析(xi)理解(jie)從(cong)0到1的(de)跨(kua)越。

注：對理解可能造成干擾的生物信息學方法專業名詞以斜體標識，有利(li)于理解的內容以黑(hei)體(ti)標識，前文出(chu)現過的類型(xing)圖不在做贅述說明。

模塊五、轉錄因子分析

分析(xi)條目12：轉錄(lu)因子分析(xi)

?分析內容：

圖10A

在轉(zhuan)錄起始位點的上游(you)，包含能夠以特定序(xu)列與基因(yin)專一性結合轉(zhuan)錄因(yin)子（Transcription Factors，TFs，轉(zhuan)錄因(yin)子使目的基因(yin)以特定的強(qiang)度在特定的時間與空間表達（圖10A）。轉(zhuan)錄有正調(diao)控和負調(diao)控之(zhi)分。

轉錄(lu)(lu)因(yin)(yin)子分析通(tong)過研究(jiu)細(xi)胞轉錄(lu)(lu)狀態(tai)的(de)(de)變(bian)化，闡述了受到(dao)外(wai)界刺激的(de)(de)細(xi)胞是如何通(tong)過轉錄(lu)(lu)因(yin)(yin)子調(diao)(diao)節基因(yin)(yin)表達(da)，從而調(diao)(diao)整細(xi)胞的(de)(de)轉錄(lu)(lu)狀態(tai)以適應新的(de)(de)環境，尤其在腫瘤(liu)微環境中轉錄(lu)(lu)狀態(tai)的(de)(de)轉變(bian)。

圖(tu)12A.基因表達的(de)調控元件

?分析方法：

轉錄因子分析(xi)也是單細胞(bao)轉錄組常(chang)見的(de)(de)分析(xi)內(nei)容，R語言分析(xi)一般(ban)采用的(de)(de)是SCENIC包（SCENIC的(de)(de)計(ji)算量(liang)超級大，非常(chang)耗費內(nei)存和時間，如非必(bi)要，不要用一般(ban)的(de)(de)電腦分析(xi)嘗試）

分析的步驟概括為：

A、基(ji)(ji)于共表達(da)算(suan)法GRNBoost2推斷轉錄因(yin)子與候選(xuan)靶基(ji)(ji)因(yin)之間的共表達(da)模(mo)塊，每個模(mo)塊包含一個調(diao)控(kong)子，即一個TF及其靶基(ji)(ji)。

B、使用(yong)cisTarget檢查(cha)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子靶基(ji)(ji)(ji)因(yin)的轉(zhuan)錄(lu)起始位點上(shang)下(xia)游，是否具有該轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子結(jie)合的保(bao)(bao)守序(xu)列(lie)motif的富(fu)集，將靶基(ji)(ji)(ji)因(yin)區分為(wei)直接(jie)靶基(ji)(ji)(ji)因(yin)和(he)間接(jie)靶基(ji)(ji)(ji)因(yin)，從而(er)保(bao)(bao)留直接(jie)靶基(ji)(ji)(ji)因(yin)，以排除假陽性。

C、使(shi)用AUCell算法對每個細胞的調控子進行(xing)活(huo)性打分。

?部(bu)分分析結果(guo)展示方式：

（1）不同分組和不同細胞類型中TopN regulons 打分(fen)聚類熱圖(tu)與(yu)UMAP圖圖（12B）：橫坐標為(wei)不(bu)同Group的cluster，縱坐標為(wei)調控子，圖注顏(yan)色(se)的變(bian)化為(wei)AUCell活性(xing)打分值。

圖12B

模塊六、細(xi)胞通訊分(fen)析(xi)

分析(xi)條目13：細(xi)胞通訊分析(xi)

?分析(xi)目(mu)的：

在生物體中，不同細胞類型和組織中的細胞相互作用(CCI)可以協(xie)調生(sheng)物的(de)發育。因此(ci)，對(dui)細胞功能的(de)研究(jiu)越來越需要考慮每(mei)個細胞間的(de)信息交流(CCC)。在單細胞轉錄組(zu)測序數據可以從基因表達中(zhong)推斷出不(bu)同細胞類(lei)型和(he)組(zu)織中(zhong)的(de)CCI和(he)CCC。

?分析(xi)原理與方法：

分析原理(li)：

（1）通過轉錄組(zu)學(xue)分析樣(yang)品或細胞(bao)，以測量(liang)基因的表達(da)；

（2）然后對生成的數(shu)據進(jin)行(xing)預處(chu)理以構建基因(yin)表達矩陣，其(qi)中(zhong)包含(han)跨不同樣品或細(xi)胞的每個基因(yin)的轉錄(lu)水(shui)平；

（3）從其(qi)他來源生成或獲得參與細(xi)胞(bao)間(jian)通訊的相互(hu)作用蛋(dan)白(bai)列(lie)表，通常包(bao)括分泌蛋(dan)白(bai)和膜結合蛋(dan)白(bai)(分別(bie)為配體和受體)之間(jian)的相互(hu)作用；

（4）在基(ji)因表(biao)達矩陣中僅保留與相互作用蛋白相關的基(ji)因。

（5）它們(men)的(de)表達水平用作輸入(ru)，使用評分(fen)函(han)數(shu)[函(han)數(shu)f (L，R)]，其(qi)中L和(he)(he)R分(fen)別是配體(ti)和(he)(he)受體(ti)的(de)表達值來計算(suan)每個配體(ti)-受體(ti)對(dui)的(de)交流得(de)(de)分(fen)。可以(yi)使用聚合函(han)數(shu)[函(han)數(shu)g (Cell 1，Cell 2)]，其(qi)中Cell 1和(he)(he)Cell 2都是這些(xie)細胞(bao)(bao)或相(xiang)應(ying)樣(yang)本的(de)所有通(tong)訊得(de)(de)分(fen)，可以(yi)匯總這些(xie)通(tong)信得(de)(de)分(fen)以(yi)計算(suan)各個樣(yang)本或細胞(bao)(bao)之間的(de)總體(ti)交互狀態；

（6）最(zui)后，可以通過Circos圖和(he)網絡可視化(hua)來(lai)表示交流和(he)匯總分數，以方便對結果進行(xing)分析解釋（圖13A）。

圖13A

原理(li)可(ke)理(li)解(jie)性概(gai)況為：通過配(pei)(pei)體(ti)細(xi)胞(bao)(bao)群(qun)和受(shou)體(ti)細(xi)胞(bao)(bao)群(qun)的配(pei)(pei)受(shou)體(ti)基因的平均表達(da)量來推測(ce)細(xi)胞(bao)(bao)存在(zai)互(hu)作(zuo)的可(ke)能(neng)性，即對應的配(pei)(pei)受(shou)體(ti)表達(da)量越(yue)高，細(xi)胞(bao)(bao)間存在(zai)互(hu)作(zuo)的可(ke)能(neng)性越(yue)高。通過置換檢驗來獲(huo)得(de)兩類(lei)細(xi)胞(bao)(bao)互(hu)作(zuo)的統(tong)計學顯著性。

?分析方(fang)法：

CellphoneDB：以(yi)單細胞基因表達數據作為輸入，整合(he)已有配(pei)受體數據庫(ku)，實現描述異構(gou)復合(he)物+預測細胞間(jian)通訊(xun)的功能，認可度高。

CellChat：使用單細胞表達譜與已知的配體、受體以及輔助(zhu)因子（激(ji)活(huo)和(he)抑制劑）來計(ji)算CCI的互作強(qiang)度。

NicheNet：輸入基因(yin)(yin)表達(da)數據，并將其(qi)與通(tong)過(guo)整合信(xin)號通(tong)路(lu)而構建(jian)的(de)模型相結合。可(ke)以預(yu)測(ce)來自一種或多種細(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)哪(na)些(xie)配體影響另(ling)一個細(xi)胞(bao)中(zhong)哪(na)些(xie)基因(yin)(yin)的(de)表達(da)，哪(na)些(xie)靶基因(yin)(yin)受到(dao)配體的(de)影響以及(ji)哪(na)些(xie)信(xin)號傳導可(ke)能參與其(qi)中(zhong)。

鏈接：單細胞測(ce)序細胞通訊分析工具優選指南

?部分分析結果(guo)展示(shi)方(fang)式：

圖13B

（1）整體(ti)通訊強度(du)貝殼(ke)圖(tu)（圖(tu)13B）：圖中的(de)節(jie)點表示(shi)不同(tong)細胞(bao)(bao)類型(xing)，節(jie)點圓圈大小表示(shi)該種細胞(bao)(bao)類型(xing)的(de)細胞(bao)(bao)數目的(de)多少(shao)，線條(tiao)粗細表示(shi)通(tong)訊強度(du)，線條(tiao)的(de)顏色與配(pei)體細胞(bao)(bao)的(de)顏色一致(zhi)。

圖13C

（2）通(tong)(tong)路通(tong)(tong)訊(xun)強度等(deng)級圖（圖13C）：每個(ge)(ge)顏(yan)(yan)色(se)的(de)點就代表(biao)(biao)一個(ge)(ge)細(xi)胞群，實心(xin)(xin)代表(biao)(biao) Source、空(kong)心(xin)(xin)代表(biao)(biao) Target，每一條(tiao)線的(de)粗細(xi)代表(biao)(biao)連結強(qiang)度。如果Source/ Target 顏(yan)(yan)色(se)同，自(zi)(zi)己連到自(zi)(zi)己且無其他(ta)連出去(qu)的(de)路徑則代表(biao)(biao)是 autocrine，而(er)若連到很(hen)多(duo)別的(de)顏(yan)(yan)色(se)則可能代表(biao)(biao)傳(chuan)導路徑當中(zhong)是 paracrine的(de)形(xing)式傳(chuan)遞物(wu)質。

圖13D

（3）通路通訊(xun)強度和(he)弦圖（圖13D）：圈(quan)：弦圖(tu)的(de)(de)外圈(quan)與(yu)內圈(quan)通常代(dai)(dai)表(biao)(biao)(biao)不同(tong)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)/細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)亞群，這些細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群是(shi)在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)通訊(xun)分析中作(zuo)為受體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)或配體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)。節點(dian)的(de)(de)位置和(he)顏色可以幫助區分不同(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)群。線：弦連接了兩個節點(dian)，表(biao)(biao)(biao)示它們之間的(de)(de)相(xiang)互(hu)作(zuo)用，弦的(de)(de)起點(dian)是(shi)配體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)（ligand），弦的(de)(de)終點(dian)是(shi)受體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)（receptor）。弦的(de)(de)粗細(xi)(xi)或顏色可以代(dai)(dai)表(biao)(biao)(biao)通訊(xun)強度、相(xiang)互(hu)作(zuo)用頻率、或是(shi)其他定(ding)量信(xin)息(xi)。越(yue)粗的(de)(de)弦表(biao)(biao)(biao)示越(yue)強的(de)(de)通信(xin)或交互(hu)作(zuo)用。在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)通訊(xun)中，配體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)受體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)相(xiang)互(hu)作(zuo)用是(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)間信(xin)號傳(chuan)遞的(de)(de)主要途(tu)徑。弦圖(tu)中的(de)(de)配體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)受體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)連接通常代(dai)(dai)表(biao)(biao)(biao)一(yi)種(zhong)特定(ding)的(de)(de)信(xin)號途(tu)徑。例(li)如，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao) A 表(biao)(biao)(biao)面(mian)的(de)(de)配體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)可能通過(guo)弦與(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao) B 表(biao)(biao)(biao)面(mian)的(de)(de)受體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)連接，表(biao)(biao)(biao)示 A 與(yu) B 之間的(de)(de)通訊(xun)。

模塊七、拷貝數變(bian)異分析(xi)

分(fen)(fen)析條(tiao)目14：拷(kao)貝數(shu)變(bian)異(yi)分(fen)(fen)析（適用于腫瘤樣(yang)本）

?分析內容：

單細(xi)(xi)胞(bao)分析中(zhong)，腫(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)鑒定常用的(de)(de)方(fang)法是通(tong)過(guo)推斷細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong) CNV 拷貝數變化來表征細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)惡性(xing)程度。分析原理(li)：inferCNV 以一組(zu)“正常”細(xi)(xi)胞(bao)作為(wei)參考（通(tong)常以免疫細(xi)(xi)胞(bao)或正常對照組(zu)中(zhong)對應細(xi)(xi)胞(bao)作為(wei)reference），分析腫(zhong)瘤(liu)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)上各(ge)個位置的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)表達量強度變化。通(tong)過(guo)熱圖的(de)(de)形式展示每(mei)條染色體上的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)相(xiang)對表達量，相(xiang)對于正常細(xi)(xi)胞(bao)，腫(zhong)瘤(liu)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)總(zong)會過(guo)表達或者低表達。

?分(fen)析步驟：

1）樣本的(de)基礎質控(kong)和注(zhu)釋(shi)，注(zhu)釋(shi)極為重要，注(zhu)釋(shi)的(de)結(jie)果(guo)直(zhi)接影響后續的(de)分析。

2）選擇合適的reference，一(yi)般(ban)文獻以(yi)待研究(jiu)的某(mou)種腫瘤細(xi)胞的正常細(xi)胞作為reference，或者以(yi)T細(xi)胞或者免(mian)疫細(xi)胞，也可以(yi)用全部正常細(xi)胞的基因平均拷貝數作為reference。

3）依據基(ji)因在染色(se)體(ti)上(shang)的位(wei)置對基(ji)因進(jin)行排序。

4）數據處(chu)理(li)，包括(kuo)腫瘤(liu)細胞與 ref的信號比較去除、數據均一化處(chu)理(li)、降低(di)噪(zao)音等過程(cheng)。

5）CNV最終的預測。

?部(bu)分分析結果展示方式：

圖14

InferCNV熱(re)圖（圖14）:圖上方的區域為CNV分析的reference細胞群(qun)/樣(yang)(yang)本(ben)(ben)，下(xia)方為需要待預測拷貝數是否發生(sheng)變異(yi)的細胞群(qun)/樣(yang)(yang)本(ben)(ben)，橫軸為染色體。顏色越紅代表(biao)基因過表(biao)達越高，越藍代表(biao)基因缺失度越高。

參考文獻：

Heterogeneity of cell composition and origin identified by single-cell transcriptomics in renal cysts of patients with autosomal dominant polycystic kidney disease. Theranostics. 2021

Combined Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal the Metabolic Evolvement of Breast Cancer during Early Dissemination. Advanced Science. 2023

Single-cell atlas of colonic CD8+ T cells in ulcerative colitis. Nat Med. 2020.

Dynamic CD8+ T cell responses to cancer immunotherapy in human regional lymph nodes are disrupted in metastatic lymph nodes. Cell. 2023.

Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. 2022

Single Cell RNA Sequencing Identifies a Unique Inflammatory Macrophage Subset as a Druggable Target for Alleviating Acute Kidney Injury. ADVANCED SCIENCE. 2022

GeneSwitches: ordering gene expression and functional events in single-cell experiments.Bioinformatics.2020

Reversed Graph Embedding Resolves Complex Single-Cell Trajectories. Nature Methods,2017