前言(yan)

在生命科學領域，單細胞測序技術被譽為“打開細胞異質性黑箱的金鑰匙”。而單細胞全(quan)長轉錄組(zu)測序（Single-cell Full-Length Transcriptome Sequencing），作(zuo)為該技術(shu)的“升級版(ban)”，不僅能夠解析(xi)單個細胞的基(ji)因表達全景，還能精準捕捉mRNA的完整(zheng)結構信息（如可變剪切、融合(he)基(ji)因、新轉錄本等）。這一(yi)技術(shu)正在推(tui)動發育生物學、腫瘤微環境(jing)、免(mian)疫治療等領域(yu)的研究(jiu)走向更深層次的突(tu)破。

一、技術原理：為(wei)什么需要“全長”測序？

傳統單(dan)細胞轉錄組測(ce)序(xu)（如10x Genomics）通(tong)常基于(yu)3’或5’端(duan)標簽捕(bu)獲，雖能高效獲取基因表達量，卻丟(diu)失了mRNA中間序(xu)列的異構體信息。而單(dan)細胞全長轉錄組測(ce)序(xu)能通(tong)過(guo)以下關鍵步(bu)驟(zou)實(shi)現“完整解析(xi)”：

1.單細胞分(fen)離：通(tong)過10x Genomics液滴微流(liu)控技(ji)術捕(bu)獲單個細胞(bao)；

2.反轉錄與(yu)擴增：在(zai)單個油包水(shui)結構中(zhong)反轉錄(lu)合成全(quan)長cDNA；

3.建庫測(ce)序：利用Oxford Nanopore長(chang)讀長(chang)測序平臺，直接讀取(qu)完整mRNA序列(lie)。

實現轉錄本 5’至(zhi) 3’端全長度覆蓋，全面解析基(ji)因(yin)結構與(yu)表達特(te)征。不僅能精確測定基(ji)因(yin)表達量(liang)，還(huan)能高效檢測轉錄本異構體(ti)（isform）、融合基(ji)因(yin)及(ji) RNA 層面突變(bian)，深度洞察基(ji)因(yin)結構變(bian)異與(yu)功能多樣(yang)性(xing)，為揭示疾病發生機制和遺(yi)傳(chuan)調控提供詳實依據。

核心優勢：精準(zhun)覆蓋轉錄本(ben)全(quan)長，敏(min)銳捕捉可(ke)變(bian)剪切、RNA 編輯(ji)、基(ji)因融合等復雜生(sheng)物事件，為(wei)深入探究(jiu)基(ji)因功(gong)能(neng)機(ji)制提供關鍵(jian)線索，全(quan)方位賦(fu)能(neng)疾病與遺傳研(yan)究(jiu)。

二、應用(yong)場(chang)景：哪些領域正在受益？

單(dan)細(xi)胞全長轉(zhuan)錄(lu)組測序，可獲得(de)完整mRNA序列(lie)，隨(sui)著單(dan)細(xi)胞研究(jiu)領(ling)域的越來越深入，在癌癥腫(zhong)瘤、神經生物學、發(fa)育生物學、免疫學等(deng)方向都有廣(guang)泛應用前景。

1、腫瘤(liu)研究：破解耐藥(yao)性與異質性

腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)胞具有(you)異(yi)質性(xing)，單(dan)(dan)細(xi)胞全長轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組測序(xu)能助我(wo)們洞悉(xi)其基(ji)因表達差(cha)異(yi)，挖掘腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)驅動基(ji)因，為精準治療提供(gong)理論支撐。比如，利用(yong) Nanopore 技(ji)術，可精準識別(bie)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)胞的(de)融合基(ji)因轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本(ben)，這些基(ji)因與(yu)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)發(fa)展緊密相(xiang)連，某些融合基(ji)因轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本(ben)可能會(hui)激活特定的(de)信(xin)號通路，促使腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)胞不(bu)斷(duan)增殖(zhi)和惡化。準確識別(bie)這些融合基(ji)因轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本(ben)，對開發(fa)靶(ba)向(xiang)藥(yao)物意(yi)義重(zhong)大。分析腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)單(dan)(dan)細(xi)胞轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組，還能找出藥(yao)物敏感或耐藥(yao)的(de)細(xi)胞亞群(qun)，助力制定更(geng)有(you)效的(de)治療方案。

2、神經科學(xue)：追蹤疾病的“剪切異(yi)常

大腦由數十億神經(jing)(jing)元(yuan)構成，極為(wei)(wei)(wei)復雜。單細(xi)胞(bao)(bao)全長轉錄組測序可解析不同神經(jing)(jing)元(yuan)的(de)(de)分子(zi)特征，揭示神經(jing)(jing)發育基(ji)因調(diao)控機制和神經(jing)(jing)系統疾(ji)病(bing)(bing)發病(bing)(bing)機理。以自閉癥、阿爾茨海(hai)默病(bing)(bing)等神經(jing)(jing)退(tui)行性疾(ji)病(bing)(bing)研(yan)究(jiu)為(wei)(wei)(wei)例(li)，運用(yong) Nanopore 單細(xi)胞(bao)(bao)測序，能清晰呈現病(bing)(bing)變細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)長鏈非編碼(ma) RNA（lncRNA）轉錄本的(de)(de)變化，它們可以通過與 DNA、RNA 或蛋白質相(xiang)互作用(yong)，影響基(ji)因的(de)(de)表達和細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)功能。這(zhe)些(xie) lncRNA 在神經(jing)(jing)發育和疾(ji)病(bing)(bing)中(zhong)起重要調(diao)控作用(yong)，為(wei)(wei)(wei)尋找治療(liao)靶(ba)點提供精(jing)準線索。

1、發(fa)育(yu)生物(wu)學：解碼細胞命運的“異構體開(kai)關”

胚(pei)胎發(fa)育(yu)時細(xi)(xi)胞(bao)分化(hua)形成(cheng)不同(tong)組(zu)織器官。單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)全長轉錄(lu)組(zu)測(ce)序可追蹤細(xi)(xi)胞(bao)分化(hua)軌跡，展(zhan)現發(fa)育(yu)中(zhong)基因表(biao)達的(de)動態變化(hua)，幫助(zhu)我們理解生(sheng)命(ming)起源與發(fa)展(zhan)。研究早期胚(pei)胎細(xi)(xi)胞(bao)分化(hua)為心臟(zang)、肝臟(zang)等器官細(xi)(xi)胞(bao)時，Nanopore 技術能準確檢測(ce)細(xi)(xi)胞(bao)分化(hua)中(zhong)的(de)可變剪(jian)接事(shi)件，同(tong)一個基因轉錄(lu)產生(sheng)的(de)前體(ti) mRNA，通過不同(tong)的(de)剪(jian)接方式，產生(sheng)多種不同(tong)的(de)成(cheng)熟 mRNA 轉錄(lu)本，進(jin)而(er)翻譯出不同(tong)的(de)蛋白質異構體(ti)。這(zhe)些(xie)異構體(ti)在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)功能和命(ming)運決(jue)定(ding)中(zhong)起著關鍵作用。這(zhe)對細(xi)(xi)胞(bao)命(ming)運決(jue)定(ding)至關重要，有助(zhu)于深入探究發(fa)育(yu)生(sheng)物(wu)學(xue)基本規律。

三、單(dan)細胞(bao)全長轉錄組測序特有分析(xi)

1、isform鑒定分析

通過使用可變的轉錄起始/終止位點、多聚腺苷酸化位點和/或可變剪接位點，同一個基因可產生不同的mRNA序列(lie)（即異(yi)構體）-isoform，它(ta)們(men)具有不(bu)同的(de)蛋(dan)白質編碼(ma)能力。

不同全(quan)長轉錄本鑒定分類特征(zheng)圖[1]

各樣(yang)本檢測到的isoform數量(liang)/類別分布圖[2]

2、融合基因檢測(ce)

可以有效檢測出細胞中存在的融合基因，即由染色體易位、倒位等結構變異導致的兩(liang)個或多(duo)個基因(yin)融(rong)合形成的新基因(yin)，對于(yu)研究腫(zhong)瘤等疾病(bing)的發生機(ji)制、診斷和治療具有重(zhong)要意(yi)義。

結(jie)構性染色(se)體重組形成(cheng)融(rong)合基因[3]

3、非編碼(ma) RNA 分析

長(chang)鏈(lian)非(fei)編碼 RNA（lncRNA）分(fen)析：可以(yi)鑒定和分(fen)析細胞(bao)中(zhong)的 lncRNA，包(bao)括(kuo)其(qi)表(biao)達(da)水平(ping)、細胞(bao)特異性表(biao)達(da)模(mo)式以(yi)及與其(qi)他基因(yin)的相互作用，探索 lncRNA 在(zai)基因(yin)調控、細胞(bao)分(fen)化和疾病發生中(zhong)的功(gong)能。

成(cheng)纖維細胞lncRNA異質(zhi)分析[4]

四、應用案(an)例(li)

案例(li)1：單細(xi)胞全(quan)長轉(zhuan)錄組測序揭(jie)示卵巢癌(ai)的基因融合和細(xi)胞轉(zhuan)變新圖(tu)景(jing)

組學研究方法：單(dan)細胞(bao)全長轉錄組(zu)測序、scRNA-seq

組(zu)學測序(xu)技術平臺：10× Genomics、Illumina、PacBio。

研究結果：

1.構(gou)建卵巢(chao)癌亞(ya)(ya)型(xing)目(mu)錄：長讀(du)長測(ce)序在 2571 個細(xi)胞中生成 2.12 億(yi) HiFi 讀(du)長，鑒定(ding)出 152,546 種亞(ya)(ya)型(xing)，30% 為新(xin)(xin)亞(ya)(ya)型(xing)，且(qie)新(xin)(xin)亞(ya)(ya)型(xing)中 42% 為蛋白質編碼，驗證了(le)長讀(du)長測(ce)序在鑒定(ding)新(xin)(xin)亞(ya)(ya)型(xing)方面(mian)的能力(li)。

2.實現(xian)細(xi)胞類(lei)型(xing)鑒定(ding)：長(chang)讀(du)長(chang)和短讀(du)長(chang)測序(xu)在細(xi)胞類(lei)型(xing)鑒定(ding)上(shang)結(jie)果相似，細(xi)胞聚類(lei)的 Jaccard 距離顯示二者高(gao)度相似，表(biao)明長(chang)讀(du)長(chang)測序(xu)可(ke)獨立進行細(xi)胞類(lei)型(xing)鑒定(ding)。

3.檢測(ce)突(tu)變和(he)(he)新連接：長讀長數據檢測(ce)到生殖系和(he)(he)體細胞(bao)突(tu)變，腫(zhong)瘤細胞(bao)中體細胞(bao)突(tu)變主(zhu)要集中在(zai) TP53 基因。腫(zhong)瘤細胞(bao)的亞(ya)型(xing)和(he)(he)轉錄表達增加，新亞(ya)型(xing)和(he)(he)新連接比例更高(gao)。

4.揭示腫瘤微環境變(bian)化：TME 中的間(jian)皮細胞和(he)基(ji)質成纖(xian)維細胞在轉移樣(yang)本中發生細胞狀態轉變(bian)，通過(guo) TGF-β/miR - 29 / 膠原蛋(dan)白軸，間(jian)皮細胞部(bu)分(fen)轉化為癌癥(zheng)相關(guan)成纖(xian)維細胞（CAFs）。

5.分析(xi)癌癥中差異(yi)(yi)亞型(xing)(xing)(xing)使用(yong)：HGSOC 細胞與(yu)遠端細胞相比，960 個基因(yin)的(de)亞型(xing)(xing)(xing)使用(yong)發生(sheng)差異(yi)(yi)，部(bu)分基因(yin)的(de)最高(gao)表(biao)達亞型(xing)(xing)(xing)生(sheng)物型(xing)(xing)(xing)改變，且使用(yong)基因(yin)水平信息估(gu)計蛋白質表(biao)達會(hui)導致 20% 的(de)高(gao)估(gu)。

6.捕獲(huo)基因(yin)融合：檢測到 34 個融合轉錄本(ben)，其中(zhong) IGF2BP2::TESPA1 融合在 Patient 2 的 HGSOC 細胞中(zhong)高度表(biao)達，短(duan)讀長數(shu)據會誤(wu)將其報告為 TESPA1 過表(biao)達。

該研究(jiu)表明，長讀長測(ce)序能夠更全面地呈現癌(ai)癥特異性變化，為精準腫瘤學(xue)研究(jiu)和個性化治療帶來(lai)新機遇，但(dan)仍需進一步提(ti)高測(ce)序深度(du)以捕獲(huo)低豐度(du)轉錄本。

案例2：單細(xi)胞全長(chang)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組測序揭示(shi)小鼠腦神經元發育(yu)成熟不同階段轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)本的(de)多樣性

組(zu)學研究方法：單(dan)細胞全長轉錄組測序、scRNA-seq

組學測序(xu)技術平臺：10× Genomics、Illumina、Nanopore

研(yan)究結果：

1.鑒定轉錄本亞型:研究利用單細胞全(quan)長(chang)轉錄組系統分(fen)析了胚胎小(xiao)鼠大腦中的(de)(de)轉錄異構體多樣性，總共(gong)發現33002個已經注(zhu)釋的(de)(de)轉錄本和4388種新的(de)(de)異構體。

2.研究通(tong)過(guo)篩(shai)選不同簇間轉錄異(yi)構(gou)體表達的(de)基(ji)因(yin)，觀(guan)察(cha)到一些基(ji)因(yin)存在細胞類(lei)型(xing)選擇性亞(ya)型(xing)使用現象，如 Clathrin light chain A（Clta）和 Myosin Light Chain 6（Myl6）在神(shen)經元成熟過(guo)程中(zhong)會發生明顯(xian)的(de)亞(ya)型(xing)轉換。

研(yan)究(jiu)結果(guo)表明單細胞全長轉錄(lu)組(zu)可用于揭示不(bu)同轉錄(lu)本在(zai)不(bu)同神經元成熟(shu)過程中不(bu)同階(jie)段的表達情況。

案例3：單細胞全長轉錄組測序(xu)揭示發育中及成年小(xiao)鼠和人類大腦中的(de)特定(ding)剪接模(mo)式

組學研究方法：單(dan)細胞(bao)全長轉錄組測序、scRNA-seq

組(zu)學測序(xu)技術(shu)平臺(tai)：10× Genomics、Illumina、Nanopore

研究結果：

1.細(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)的(de)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)變異(yi)(yi)(yi)特征：研究收集了(le)小鼠在(zai)(zai)(zai)出生后(hou)不同時間(jian)點（P14、P21、P28和P56）以及成年時期（P56）的(de)五個腦(nao)區樣本(ben)（視覺(jue)皮層(ceng)、海馬、小腦(nao)、紋狀體(ti)和丘腦(nao)），對其進行單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)RNA測序和單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)全(quan)長(chang)轉錄組測序，共得到4種主要細(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)（神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)元細(xi)(xi)胞(bao)、神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)膠質細(xi)(xi)胞(bao)、血管細(xi)(xi)胞(bao)和免(mian)疫細(xi)(xi)胞(bao)）。不同細(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)在(zai)(zai)(zai)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)變異(yi)(yi)(yi)模式上(shang)存在(zai)(zai)(zai)顯著差異(yi)(yi)(yi)，神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)元的(de)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)變異(yi)(yi)(yi)高于(yu)神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)膠質細(xi)(xi)胞(bao)和祖細(xi)(xi)胞(bao)。興奮性神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)元的(de)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)變異(yi)(yi)(yi)主要體(ti)現在(zai)(zai)(zai)細(xi)(xi)胞(bao)亞型(xing)間(jian)，而抑制性神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)元在(zai)(zai)(zai)年齡和腦(nao)區之間(jian)變異(yi)(yi)(yi)明顯。

2.大腦區域(yu)特異(yi)性(xing)剪接：丘腦和小(xiao)腦的星形(xing)(xing)膠質(zhi)細胞表現出較強的轉錄起(qi)始位點（TSS）、聚腺苷酸化（poly (A)）位點和外顯子調控。神經(jing)元在(zai)不(bu)同腦區的 TSS 和 poly (A) 位點使用差異(yi)比星形(xing)(xing)膠質(zhi)細胞更高，且 TSS 使用更具區域(yu)特異(yi)性(xing)。

3.可(ke)變外(wai)顯(xian)子的特征與(yu)功(gong)能(neng)：鑒定出 4557 個高可(ke)變外(wai)顯(xian)子（hVExs）和不同類別的極可(ke)變外(wai)顯(xian)子（EVExs），這些外(wai)顯(xian)子與(yu)細(xi)胞功(gong)能(neng)和疾病(bing)相關(guan)。部(bu)分 EVExs 在人(ren)類和小鼠中保守，且受 RBP 調控，與(yu)疾病(bing)相關(guan)的 sQTLs 有關(guan)。

4.發育(yu)過程中(zhong)的(de)(de)異(yi)構體調控：青(qing)春期(qi)（P21 - P28）大腦(nao)區域特異(yi)性會短暫增加，部分基因(yin)的(de)(de)異(yi)構體表(biao)達在(zai)該(gai)時(shi)期(qi)發生顯(xian)著變化(hua)。同時(shi)，在(zai)發育(yu)過程中(zhong)，剪接和基因(yin)表(biao)達定(ding)義的(de)(de)神經膠質成熟存在(zai)不一致性，且外顯(xian)子變異(yi)呈現波(bo)動模式。

研究揭(jie)示了大(da)腦中(zhong) RNA 亞(ya)型(xing)(xing)(xing)表(biao)達(da)在細(xi)胞類(lei)型(xing)(xing)(xing)、腦區和發育(yu)階段的(de)廣(guang)泛差(cha)異，明確了不同外顯子類(lei)別(bie)與蛋(dan)白質(zhi)功能的(de)關聯(lian)，發現小鼠(shu)成(cheng)年細(xi)胞類(lei)型(xing)(xing)(xing)的(de)變異在人類(lei)中(zhong)大(da)多保(bao)守，且(qie)發育(yu)過程中(zhong)的(de)異構(gou)體(ti)波動比成(cheng)年腦區間的(de)差(cha)異更大(da)，強調(diao)了研究異構(gou)體(ti)表(biao)達(da)時同步記錄基因表(biao)達(da)和剪(jian)接的(de)必要性。

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