2025-03-24
Highlights
1.本文(wen)研究鹽分對海洋和河灘土壤抗性組(zu)分布模式的(de)影響。
2.了解 ARGs 區(qu)域(yu)分布模(mo)式及(ji)其影響因素，有(you)助(zhu)于評(ping)估(gu)人類(lei)接觸 ARGs 的(de)風險，高通量 qPCR極大地提高了檢(jian)測效率(lv)，更加(jia)全(quan)面的(de)評(ping)估(gu)ARGs分布模(mo)式。
3.派(pai)森(sen)諾構建完備且嚴(yan)謹的數據(ju)(ju)分(fen)析流(liu)程，依(yi)托專(zhuan)業的生(sheng)物信息學(xue)分(fen)析技(ji)術，對(dui)高通量 qPCR 產出的海量數據(ju)(ju)展開深度挖(wa)掘與解析，以多元可視化形式全方位呈現數據(ju)(ju)，讓數據(ju)(ju)價值(zhi)直觀彰顯。
文章題(ti)目：Salinity as a predominant factor modulating the distribution patterns ofantibiotic resistance genes in ocean and river beach soils
期(qi)刊(kan)：Sci Total Environ
發表時間：2019年6月
研究(jiu)背景
細(xi)菌(jun)對(dui)抗(kang)菌(jun)藥(yao)物的耐(nai)(nai)藥(yao)性發展(zhan)是(shi)全球公共衛生(sheng)(sheng)和(he)現代(dai)醫學的重大挑戰，抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)等(deng)雖被(bei)(bei)視為環境(jing)中(zhong)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)耐(nai)(nai)藥(yao)基因(yin)增殖的主要(yao)壓(ya)力，但(dan)無法完(wan)全解(jie)釋其(qi)在(zai)自然(ran)環境(jing)中(zhong)的廣(guang)泛存在(zai)。細(xi)菌(jun)系統發育和(he)重金(jin)屬作(zuo)用已被(bei)(bei)記載(zai)，但(dan)對(dui)其(qi)他環境(jing)因(yin)素(su)(su)影(ying)(ying)響土(tu)壤(rang)(rang)耐(nai)(nai)藥(yao)性了解(jie)有限。海洋和(he)河流(liu)沙灘土(tu)壤(rang)(rang)是(shi)人(ren)類活動熱點，是(shi)環境(jing)和(he)人(ren)類耐(nai)(nai)藥(yao)組(zu)(zu)的重要(yao)界(jie)面，沙灘土(tu)壤(rang)(rang)高鹽(yan)度(du)會影(ying)(ying)響微(wei)生(sheng)(sheng)物群落結構，但(dan)缺乏鹽(yan)度(du)對(dui)土(tu)壤(rang)(rang)耐(nai)(nai)藥(yao)組(zu)(zu)影(ying)(ying)響的實證，本研(yan)究通過 HT-qPCR 分析沙灘土(tu)壤(rang)(rang)樣本中(zhong)的抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)耐(nai)(nai)藥(yao)基因(yin)，量化(hua)土(tu)壤(rang)(rang)耐(nai)(nai)藥(yao)組(zu)(zu)并確定影(ying)(ying)響其(qi)分布的因(yin)素(su)(su)。
研究思路
采樣：所有采樣(yang)地(di)點均位于市區范圍內，與(yu)人類活(huo)動密切相關。在每個地(di)點，一個土(tu)壤樣(yang)本采集(ji)0-15 cm厚的5個土(tu)芯，置于冰上(shang)運(yun)送至實驗室(shi)。使用MoBio PowerSoil DNA extraction kit提取(qu)試(shi)劑盒(he)(he)從(cong)0.25 g土(tu)壤中提取(qu)土(tu)壤DNA。嚴(yan)格(ge)按照(zhao)試(shi)劑盒(he)(he)說明書進行提取(qu)，。通過NanoDrop 2000進行檢測，濃度>15 ng μl ?1，A260/A280 > 1.8 and A260/230 >2.0。
土(tu)壤理(li)化特性：檢測(ce)土壤鹽分，總(zong)氮和(he)總(zong)碳等理化指標。
高通量定量PCR（HT-qPCR）分(fen)析(xi)：使(shi)用HT-qPCR分(fen)析(xi)以定量抗(kang)生素抗(kang)性基因(yin)和可移(yi)動遺傳元件。296對(dui)(dui)引物，其中(zhong)包(bao)括285個(ge)(ge)抗(kang)生素類(lei)的(de)ARGs、9個(ge)(ge)MGEs（8個(ge)(ge)轉(zhuan)座酶(mei)(mei),1個(ge)(ge)通用的(de)I類(lei)整合子(zi)整合酶(mei)(mei)基因(yin) cintI-1 ）、1個(ge)(ge)臨床(chuang)I類(lei)整合子(zi)整合酶(mei)(mei)基因(yin) intI-1和16S rRNA基因(yin)。使(shi)用無菌(jun)水將所(suo)有DNA樣品稀釋(shi)至15 ng.μl ?1，并在Wafergen SmartChip實時PCR系統上對(dui)(dui)每個(ge)(ge)樣品進行(xing)一式三份分(fen)析(xi)。以31為檢測限，使(shi)用比較CT方法，計算ARGs和MGEs相對(dui)(dui)于16 S rRNA基因(yin)的(de)相對(dui)(dui)豐度。
高(gao)通量(liang)測序(xu)技術研究土壤(rang)微生(sheng)物以(yi)及抗生(sheng)素抗性(xing)基(ji)因(yin)（ARGs）：去除(chu)低質(zhi)量(liang)序(xu)列、定義(yi) OTU、分(fen)類(lei)學分(fen)類(lei)等(deng)(deng)。對ARGs 的空間分(fen)布、相對豐度、細菌群落(luo)差(cha)異等(deng)(deng)進行分(fen)析，并探究 ARGs 與可(ke)移動遺傳元件（MGEs）以(yi)及土壤(rang)性(xing)質(zhi)之間的相關(guan)性(xing)。通過隨(sui)機森林分(fen)析分(fen)析影(ying)響 ARGs 豐度的主(zhu)要預(yu)測因(yin)子，構建結(jie)構方程模型評(ping)估(gu)環境(jing)因(yin)素和樣本(ben)類(lei)型對ARGs模式(shi)的影(ying)響。
結果(guo)展示
圖1：(a) 基(ji)(ji)(ji)于(yu)所(suo)有沙灘土壤樣本(ben)中(zhong)(zhong)(zhong)檢測到(dao)的抗生素(su)(su)抗性基(ji)(ji)(ji)因（ARGs）數量(liang)，對(dui) ARGs 進(jin)行分類，多藥(yao)耐藥(yao)和β-內酰(xian)胺耐藥(yao)）分別占檢測到(dao)的ARGs總數的32.7%和22.7%，氨基(ji)(ji)(ji)糖苷類（12.7%）、MLSB（10.9%）和四環(huan)(huan)素(su)(su)類（7.3%）；(b) ARGs 耐藥(yao)機制，外排(pai)泵（42.7%）、抗生素(su)(su)失活（40.9%）和細胞保護（15.5%）；(c) 所(suo)有樣本(ben)中(zhong)(zhong)(zhong) ARGs 和MGEs的相對(dui)豐度；(d) 每個(ge)采樣點中(zhong)(zhong)(zhong) ARGs 和 MGEs 的相對(dui)豐度。（縮(suo)寫(xie)：MLSB，大環(huan)(huan)內酯 - 林可酰(xian)胺 - 鏈陽菌素(su)(su)B耐藥(yao)；FCA，氟(fu)喹(kui)諾酮、喹(kui)諾酮、氟(fu)苯尼(ni)考、氯(lv)(lv)霉素(su)(su)和氯(lv)(lv)霉素(su)(su)類抗生素(su)(su)抗性基(ji)(ji)(ji)因）。
圖2：土壤(rang)樣本(ben)中檢測到的(de)各(ge)個(ge)抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)抗(kang)(kang)性基因(yin)（ARGs）和可移(yi)動遺傳元件（MGEs）亞型的(de)相對豐度。ARGs 亞型的(de)類別(bie)以及核(he)心耐藥(yao)組在(zai)右側進(jin)行了標(biao)注。所(suo)有土壤(rang)樣品(pin)（熱圖中的(de)列）通(tong)常分(fen)為兩(liang)個(ge)主要集(ji)群(qun)，集(ji)群(qun)I包含27個(ge)海洋(yang)海灘土壤(rang)，集(ji)群(qun)II包括從海洋(yang)和河流海灘收(shou)集(ji)的(de)34個(ge)土壤(rang)樣品(pin)。
圖3：(a) 與總(zong)ARGs相(xiang)比(bi)，核心耐(nai)藥(yao)基因(yin)組的(de)(de)數量和(he)相(xiang)對(dui)豐度的(de)(de)百(bai)分比(bi);（b）核心耐(nai)藥(yao)基因(yin)組的(de)(de)分類組成（僅(jin)標記(ji)每個(ge)類別中(zhong)的(de)(de)優(you)勢ARGs亞型）。
圖4：基于相關(guan)性分析的(de)ARGs和MGEs共現模式網(wang)絡，具(ju)有不(bu)同(tong)顏色的(de)節點表示(shi)(a)不(bu)同(tong)類別的(de)ARGs；(b)MGEs的(de)intI1、tnpA1、tnpA2和tnpA3基因被聚(ju)為不(bu)同(tong)的(de)模塊(kuai)，并與(yu)ARGs密切相關(guan)。
圖5：根(gen)據Na+、Cl-濃度(du)(du)梯度(du)(du)以及電導率(lv)的(de)鹽度(du)(du)梯度(du)(du)變(bian)化(hua)，對比(bi)抗生素(su)抗性基因（ARGs）和(he)可移(yi)動遺傳元件(jian)（MGEs）的(de)相對豐(feng)度(du)(du)。隨著Na+，Cl-，EC增加，ARGs和(he)MGE的(de)相對豐(feng)度(du)(du)顯著增加。
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總 結(jie)
海灘土(tu)(tu)壤(rang)(rang)中 ARGs 豐富多樣，是(shi)(shi)(shi)耐(nai)(nai)(nai)(nai)藥性重要(yao)(yao)儲存庫(ku)。β-內(nei)酰胺類和多藥耐(nai)(nai)(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)是(shi)(shi)(shi)主要(yao)(yao)亞(ya)型，鑒定(ding)出的(de)(de)核心(xin)(xin)耐(nai)(nai)(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組含多種與臨床相(xiang)關基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，可(ke)(ke)能(neng)危(wei)害(hai)人(ren)類健康(kang)，其鑒定(ding)有助于預(yu)測(ce)耐(nai)(nai)(nai)(nai)藥性傳播。MGEs豐度(du)高，與ARGs總(zong)量(liang)、核心(xin)(xin)耐(nai)(nai)(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組及不同類別ARGs顯著相(xiang)關，表明ARGs有水(shui)平(ping)轉移(yi)潛力。MGEs介(jie)導(dao)的(de)(de)水(shui)平(ping)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)轉移(yi)可(ke)(ke)使 ARGs與細菌系統發育(yu)關系脫鉤，是(shi)(shi)(shi)塑造核心(xin)(xin)耐(nai)(nai)(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組和ARGs總(zong)量(liang)的(de)(de)重要(yao)(yao)因(yin)(yin)(yin)(yin)素。同時，土(tu)(tu)壤(rang)(rang)鹽度(du)相(xiang)關變(bian)量(liang)是(shi)(shi)(shi) ARGs 圖(tu)譜重要(yao)(yao)預(yu)測(ce)因(yin)(yin)(yin)(yin)子，是(shi)(shi)(shi)調(diao)節ARGs分布模(mo)式最重要(yao)(yao)環(huan)境因(yin)(yin)(yin)(yin)素。鹽度(du)增(zeng)加，ARGs 有上升趨勢，鹽度(du)可(ke)(ke)直接促進ARGs進化流行，還可(ke)(ke)通過影響MGEs、土(tu)(tu)壤(rang)(rang)有機質溶解(jie)度(du)、重金屬遷(qian)移(yi)性、土(tu)(tu)壤(rang)(rang)pH值及細菌群落結構間接影響耐(nai)(nai)(nai)(nai)藥基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組。
本研(yan)究首次(ci)深(shen)入海洋與河流海灘(tan)的(de)(de)土(tu)(tu)壤環境(jing)，探尋抗(kang)生素抗(kang)性基(ji)因（ARGs）的(de)(de)奧秘，收(shou)獲了(le)(le)意義非凡的(de)(de)證據。研(yan)究發現，土(tu)(tu)壤鹽度在塑造這些(xie)生態(tai)系統中(zhong)耐(nai)藥基(ji)因組圖譜方面，扮演著至(zhi)(zhi)關(guan)重(zhong)要(yao)的(de)(de)角色(se)。諸如鹽度這類環境(jing)壓(ya)力，可能會增強細(xi)菌對廣譜抗(kang)生素的(de)(de)耐(nai)藥性。鑒(jian)于環境(jing)中(zhong)的(de)(de)ARGs在鹽度脅迫條(tiao)件下(xia)，存(cun)在傳(chuan)播至(zhi)(zhi)人(ren)類病原體或細(xi)菌的(de)(de)潛在風(feng)險，此研(yan)究具(ju)有重(zhong)要(yao)的(de)(de)公共衛生意義。深(shen)入了(le)(le)解維(wei)持環境(jing)抗(kang)性的(de)(de)環境(jing)壓(ya)力，對于制定有效策略以(yi)最(zui)大程度減少ARGs 傳(chuan)播至(zhi)(zhi)關(guan)重(zhong)要(yao) 。
